嗎啡對μ阿片受體介導的ERK磷酸化的影響

邊佳明,張梅

(北京軍區總醫院藥理科,北京 100700)

嗎啡對μ阿片受體介導的ERK磷酸化的影響

邊佳明,張梅

(北京軍區總醫院藥理科,北京 100700)

目的 利用表達μ阿片受體的中國倉鼠卵巢細胞,研究嗎啡急慢性處理下對細胞外信號調節激酶(ERK)磷酸化的影響。方法免疫印跡檢測磷酸化ERK水平,獲取1 h急性處理的ERK磷酸化變化時程和36 h慢性處理以及納洛酮催促下的ERK磷酸化變化。結果1 μmol·L-1嗎啡可以快速誘導ERK磷酸化水平短暫升高,5 min時達峰(P＜0.01),嗎啡誘導的ERK磷酸化水平升高具有顯著的濃度依賴性。10 μmol·L-1嗎啡慢性處理36 h后ERK磷酸化水平與對照組比較,差異無統計學意義,但納洛酮急性催促5或10 min均導致ERK磷酸化顯著下降(與對照比較,P＜0.01)。結論嗎啡急慢性刺激下以及納洛酮催促下ERK磷酸化表現出不同的變化形式,提示μ阿片受體介導下ERK相關的信號通路發生了代償。

嗎啡;μ阿片受體;卵巢細胞;細胞外信號調節激酶;磷酸化

阿片受體是典型的G蛋白耦聯受體,通過耦聯Gi/o蛋白,激活腺苷酸環化酶(adenylate cyclase,AC)Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ(ACⅠ、Ⅴ、Ⅵ),從而抑制環單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信號通路[1]。細胞內信號轉導存在廣泛的對話(cross talk)機制,研究不同信號轉導通路間的對話對了解信號轉導機制,尋找新的干預靶點十分有意義。酪氨酸激酶受體激活的有絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是細胞內另一條極其重要的信號通路,其家族中Raf-MEK-ERK級聯通路與細胞的生長、分化、存活密切相關[2]。筆者利用表達外源性μ阿片受體的中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細胞,研究嗎啡急慢性處理下細胞外信號調節激酶(extracellular regulated kinase,ERK)磷酸化的變化,以期了解嗎啡刺激下μ阿片受體介導的ERK磷酸化的變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料 硫酸嗎啡,購自青海制藥公司(批號: 040618,純度:99%);鹽酸納洛酮(批號:1028107,純度:99%)、苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride,PMSF,批號:378212,純度:99%)等購自Sigma-Aldrich(美國);小鼠抗磷酸化ERK(T204)單克隆抗體(批號:I1009)、兔抗ERK單克隆抗體(批號: I0408)購自Santa Cruz(美國);辣根過氧化物酶標記的二抗(批號:20100112)購自北京中杉金橋生物技術有限公司;DMEM/F12培養液(批號:M76598)和G418 (批號:K27184)購自Invitrogen(美國);高靈敏增強化學發光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL,批號: S120987)購自Millipore(美國);其余所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器 蛋白電泳和轉印采用Bio-rad電泳儀(美國),凝膠成像和分析采用Alpha凝膠成像系統(美國),蛋白濃度測定通過島津UV160-A型紫外分光光度儀(日本)完成。

1.3 細胞培養和藥物處理 穩定表達μ阿片受體的CHO細胞(CHO/μ)由軍事醫學科學院提供(2.9 pmol·mg-1膜蛋白)[3],維持于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液中,含1×105U·L-1青霉素, 100 mg·L-1鏈霉素和200 mg·L-1的G418,37℃,5%二氧化碳(CO2)培養。細胞正常傳代培養。

對于藥物急性刺激,藥物處理前24 h,細胞以4×105個種于6孔板,待細胞達到80%～90%融合,撤血清過夜,根據圖注中描述的方法處理細胞;對于慢性給藥,細胞以密度1×105個種于6孔板,貼壁后用含藥完全培養液繼續培養細胞36 h(期間換含藥培養液1次)。

1.4 免疫印跡 細胞經藥物處理完畢后,立即將6孔板置于冰面,傾倒含藥培養液,4℃磷酸緩沖液(phosphat buffered solution,PBS)洗2次,吸干殘留液體,加入4℃細胞裂解液60 μL[含三羥甲基氨基甲烷( tris hydroxylmethyl aminomethane,TRIS)50 mmol·L-1,氯化鈉(NaCl)150 mmol·L-1,乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)1 mmol·L-1,依他酸(egtazic acid,EGTA)1 mmol·L-1,1%聚氧乙烯壬基苯醚40[Nonyl phenoxypoly(ethyleneoxy)ethanol-40,NP-40],PMSF1 mmol·L-1;以及蛋白酶抑制劑cocktail和磷酸酶抑制劑(pH=7.4),立即用細胞刮將細胞刮下收集入1.5 mL離心管,所有操作在冰上進行。冰上繼續裂解20 min,之后12 000 r·min-1(r=70 mm),4℃,離心20 min,小心吸取上清液,考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。

蛋白免疫印跡參照文獻[4]中蛋白免疫印跡法進行。取各組樣品蛋白20 μg用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,半干轉印法將蛋白轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗4℃孵育過夜。ECL顯影,凝膠成像儀拍照,對每個條帶的光密度值進行分析。需要再生的膜用適量膜再生液37℃,80 r·min-1,孵育1 h,洗凈膜再生液后,孵育其他一抗。圖1～4中所示印記條帶上方為p44(ERK1),下方為p42(ERK2)。

1.5 統計學方法 采用Alpha View軟件中自帶的光密度分析模塊,自動扣除背景,獲取光密度值。所有數據來源于3或4次獨立的實驗,以均數±標準差(±s)表示,ERK的磷酸化水平(pERK1/2)用總ERK量(ERK1/2)均一化,并設定對照組為1,其余給藥組表示為對照組的倍數。全部數據統計分析由GraphPad 5.0軟件完成,統計方法見圖注,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 嗎啡急性刺激下激活ERK磷酸化的時效關系和量效關系 1 h時效曲線顯示,與對照(0 min)相比, 1 μmol·L-1嗎啡處理5 min(q=4.770)和10 min(q= 3.814)時,導致ERK磷酸化水平顯著升高,并在5 min達峰,約是對照的2.3倍,隨后逐漸降低,20 min時接近對照水平,與對照比較,差異無統計學意義(圖1)。嗎啡急性處理5 min的量效關系結果顯示,1～10 μmol·L-1嗎啡可以濃度依賴性地引起ERK磷酸化水平升高,與對照(無藥物刺激)比較, 0.1 μmol·L-1(q=3.607)、1 μmol·L-1(q=6.885)和10 μmol·L-1(q=9.309)嗎啡均可顯著誘導ERK磷酸化水平升高,誘導程度與嗎啡濃度呈正比(圖2)。為確證ERK磷酸化是由μ阿片受體激動所致,使用阿片受體拮抗藥納洛酮(NLX)預處理細胞后再用嗎啡刺激,結果顯示納洛酮預處理使嗎啡誘導的ERK激活完全消失(q=6.776,圖3),提示ERK磷酸化是由于μ阿片受體激動所致。

1 μmol·L-1嗎啡不刺激或刺激細胞5,10,20,30,60 min,結束后立即裂解收集,蛋白免疫印跡分析;n=3,單因素方差分析,Dunnett's post-hoc檢驗,與對照(0 min)比較,*1P＜0.01圖1 嗎啡誘導ERK磷酸化的時效曲線Cells were exposed in vehicle or 1 μmol·L-1morphine for 5, 10,20,30,60 min,then lysed and collected for immunoblots.n=3. One-way ANOVA was used followed by Dunnett's post-hoc test,*1P＜0.01,compared with control(0 min)Fig.1 Time-effect curve of morphine-induced ERK phosphorylation

2.2 慢性嗎啡處理對ERK磷酸化的影響 本實驗通過嗎啡慢性處理來了解ERK通路做出的反應,同時為模仿嗎啡長期用藥后引起的戒斷反應,在嗎啡處理36 h后,再用納洛酮催促戒斷。觀察ERK磷酸化的變化模式。因此將細胞分為對照組(0.9%氯化鈉溶液處理36 h),嗎啡慢性處理組(嗎啡處理36 h),納洛酮催促5 min組和納洛酮催促10 min組。結果顯示(圖4),10 μmol·L-1嗎啡慢性處理細胞36 h后,與對照組比較,ERK磷酸化水平無顯著性改變,提示ERK磷酸化對嗎啡的持續刺激表現為脫敏。但納洛酮催促后,與對照組比較,ERK磷酸化水平顯著降低(均P＜0. 01,5 min:q=18.64,10 min:q=20.29),5 min納洛酮催促與10 min納洛酮催促比較差異無統計學意義。

不同濃度嗎啡刺激細胞5 min,結束后立即裂解收集,蛋白免疫印跡分析;n=3,單因素方差分析,Dunnett's post-hoc檢驗,與對照組(0 min)比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05圖2 嗎啡誘導ERK磷酸化的量效曲線Cells were stimulated by serial concentration of Morphine for 5 min,then lysed and collected for immunoblots.n=3.One-way ANOVA was used followed by Dunnett's post-hoc test,*1P＜0.01,*2P＜0.05,compared with the control group(0 min)Fig.2 Dosage-effect curve of morphine-induced ERK phosphorylation

3 討論

ERK通路是一條將胞外信號轉移至細胞核的重要途徑,該通路通過三級蛋白激酶(Raf-MEK-ERK)級聯磷酸化而逐次激活,其中ERK包括ERK1和ERK2兩個亞型,ERK1和ERK2的活化(即磷酸化)是將信號轉移至核的關鍵[5]。研究發現,阿片受體通路與ERK通路的對話可能參與到阿片依賴當中[6],ERK活性對于藥物引起的關聯性記憶來說是不可或缺的[7]。阿片受體通路與ERK通路之間對話的機制尚不清楚,但正是這種對話機制的存在,阿片受體既可通過經典的cAMP通路調節基因表達;又可通過ERK通路調節基因表達,從而實現轉錄水平的精細調控[1]。利用表達μ阿片受體的CHO細胞,研究經典藥物嗎啡急慢性刺激下對ERK活性的影響,以便在體外水平闡述阿片受體在不同激活狀態下ERK通路的活性變化模式。

Con:對照溶劑處理細胞;NLX+morphine:10 μmol·L-1納洛酮預處理細胞30 min后,再加1 μmol·L-1morphine處理5 min;morphine:對照溶劑處理30 min后,再用1 μmol·L-1嗎啡處理5 min。n=4,單因素方差分析,Dunnett's post-hoc檢驗,與對照組(Con)比較,*1P＜0.01圖3 納洛酮完全拮抗嗎啡誘導的ERK磷酸化Con:cells were stimulated by vehicle;NLX plus morphine: cells were pretreated by 10 μmol·L-1of Naloxone for 30 min,and then stimulated by 1 μmol·L-1of Morphine for 5 min;Morphine: cells were pretreated by vehicle for 30 min,and then stimulated by 1 μmol·L-1of Morphine for 5 min.n=4,One-way ANOVA was used followed by Dunnett's post-hoc test,*1P＜0.01,compared with the control group(Con)Fig.3 Antagonism of naloxone on morphine-induced ERK phosphorylation

對照組(Con)以對照溶劑慢性處理細胞36 h,Mor-36 h組, Nlx-5 min組以及Nlx-10 min組以10 μmol·L-1嗎啡處理細胞36 h,之后催促組(Nlx-5 min,Nlx-10 min)用完全培養液潤洗2次,納洛酮5 μmol·L-1處理5或10 min。處理完成后,蛋白免疫印跡分析。n=3,單因素方差分析,Dunnett's post-hoc檢驗,與con比較,*1P＜0.01圖4 嗎啡慢性處理36 h以及納洛酮催促對ERK磷酸化的影響Cells were exposed in 10 μmol·L-1morphine(Mor-36 h)or vehicle(Con)for 36 h,and then were washed twice with culture medium,and the withdrawal was preceded by precipitating the cells with 5 μmol·L-1naloxone for 5 min(NLX-5 min)or 10 min (NLX-10 min).n=3,One-way ANOVA was used followed by Dunnett's post-hoc test,*1P＜0.01,compared with control groupFig.4 Effect of chronic morphine treatment for 36 h and naloxone precipitation on ERK phosphorylation

時效數據顯示,1 μmol·L-1嗎啡可以瞬時刺激細胞磷酸化ERK水平顯著升高,5 min時即達到最大刺激水平,隨后下降,至20 min時已差異無統計學意義,提示MOR的激活可以立即通過ERK通路對下游靶基因進行調節,但這種調節是瞬時的,ERK的活性很快恢復到了靜息水平。量效數據顯示,在10-9～10-5mol·L-1濃度范圍內嗎啡可以劑量依賴性的增強急性ERK磷酸化升高的程度,提示嗎啡給予的劑量與ERK活性正相關。嗎啡長時間的刺激將導致信號通路的代償性適應,以cAMP為例,嗎啡急性刺激抑制cAMP合成,但長時間的嗎啡刺激將導致AC活性代償性的升高,此時一旦去除嗎啡并給予阿片受體拮抗藥納洛酮處理,將導致cAMP水平迅速大幅升高,形成所謂的cAMP超射現象[8]。同樣,嗎啡慢性處理下ERK通路一定也存在某種形式的代償性適應,而且納洛酮催促后可能會出現某種形式的“戒斷”反應。本實驗數據顯示,10 μmol·L-1嗎啡慢性處理細胞36 h后,ERK的活性水平與對照比較沒有顯著性變化,提示存在某種機制使得ERK磷酸化對嗎啡的刺激脫敏;而用納洛酮催促戒斷后立即觀察可見ERK活性的極其顯著下降,提示這種代償性機制在沒有了嗎啡的刺激后得到放大,可能因此導致了ERK磷酸化水平的顯著下降。筆者推測,納洛酮催促導致的ERK活性下降或許與cAMP超射有關。有文獻顯示,PKA可以磷酸化Raf-1 (Raf激酶的一個重要亞型)的一個抑制型位點導致Raf-1活性被抑制[9],因此,納洛酮誘導的cAMP水平迅速升高或許引起了PKA活性的快速升高,從而導致Raf-1活性被抑制,繼而導致ERK磷酸化水平下降。但這種代償機制的設想還需要進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.012

Effects of Morphine on μ Opioid Receptor-mediated ERK Phosphorylation

BIAN Jia-ming,ZHANG Mei
(Department of Pharmacology,Military General Hospital of Beijing PLA,Beijing 100700,China)

ObjectiveTo study the phosphorylation mode of extracellular regulated kinase(ERK)induced by acute and chronic morphine treatment on Chinese hamster ovary(CHO)cells expressed with μ opioid receptors.MethodsThe time course of ERK phosphorylation 1 h and 36 h after morphine exposure as well as naloxone-precipitated withdrawal was detected by immunobloting.ResultsA transient enhancement of ERK phosphorylation was induced by 1 μmol·L-1morphine with the peak effect at 5 min(P＜0.01),and the effect was dose-dependent.No difference in ERK phosphorylation was found after 36h of treatment with 10 μmol·L-1morphine compared with the control.However,5 or 10 min-naloxone precipitation induced remarkable decrease in ERK phosphorylation compared with the control(P＜0.01).ConclusionDifferent changes of ERK phosphorylation were found under acute and chronic morphine treatment and naloxone precipitation,indicating a compensation of ERK related pathway induced by μ opioid receptors.

Morphine;μ opioid receptor;Ovary cells;ERK;Phosphorylation

R971;R965

A

1004-0781(2014)11-1446-04

2013-11-15

2013-12-05

邊佳明(1976-),男,內蒙古集寧人,主管藥師,博士,研究方向:分子藥理學、遺傳藥理學。電話:010-66721898,E-mail:bianbenjamin@163.com。