紫杉醇熱敏脂質體的制備與質量控制

李志平,趙希青,,趙詩情,,張慧,劉燕,肖若蕾

(1.軍事醫學科學院毒物藥物研究所,北京 100850;2.湖北科技學院藥學院,咸寧 437100)

紫杉醇熱敏脂質體的制備與質量控制

李志平1,趙希青1,2,趙詩情1,2,張慧1,劉燕1,肖若蕾2

(1.軍事醫學科學院毒物藥物研究所,北京 100850;2.湖北科技學院藥學院,咸寧 437100)

目的 制備紫杉醇熱敏脂質體,建立測定其含量、有關物質及溶血磷脂的方法,考察其含量、有關物質、溶血磷脂量以及體外溶血性。方法采用高效液相色譜(HPLC)-紫外法檢測制劑含量及有關物質,HPLC-電霧式檢測器檢測制劑中溶血磷脂單棕櫚酰磷脂酰膽堿的量,并對檢測方法進行驗證;分光光度法測定體外溶血百分率。結果紫杉醇在60.39～181.17 μg·mL-1范圍內峰面積與濃度線性關系良好,回收率及精密度實驗均符合要求;有關物質測定方法專屬性、靈敏度和系統適用性均符合要求;溶血磷脂測定方法的專屬性和靈敏度符合有關規定,在1.5～50.0 μg·mL-1范圍內峰面積與濃度線性關系良好,回收率、重復性均符合要求;3批自制紫杉醇熱敏脂質體的含量在90.0%～110.0%之間,單個雜質含量均＜0.5%,總雜質含量均＜2.0%,體外基本不引起溶血。結論含量、有關物質及溶血磷脂檢測方法均可用于紫杉醇熱敏脂質體的質量評價,自制紫杉醇熱敏脂質體各項指標均符合要求,且質量穩定。

紫杉醇熱敏脂質體;溶血性;色譜法,高效液相;質量控制

紫杉醇(paelitaxel)是目前應用于臨床的一線廣譜抗腫瘤藥物[1-2],但市售制劑(如注射劑及注射用紫杉醇脂質體)可產生肝臟毒性、神經毒性和心血管毒性等多種嚴重不良反應,這不僅與藥物自身性質有關,同時也與制劑中使用的輔料、溶媒如聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL)、無水乙醇,以及制劑形式有關[2-3]。為降低輔料及溶媒所產生的毒性和不良反應,增加病灶局部的藥量,降低全身副作用,本實驗室制備了紫杉醇熱敏脂質體(long-circulating temperature-sensitive liposomes with paclitaxel,LTSLP)[4-5],該制劑經實驗證實具有增效減毒效果,具有良好的應用前景。為保證所制備LTSLP的質量,筆者在本實驗中對LTSLP進行了系統的質量研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Hitachi公司,2130型), Corona電霧式檢測器(美國ESA公司),色譜柱(Agilent,Vensuil XBP C8,4.6 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 試藥 紫杉醇原料(桂林暉昂生物制藥有限公司,批號:JF20090303,純度:99.9%)。二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine,DPPC,批號: A71289,純度:99.8%)、溶血磷脂單棕櫚酰磷脂酰膽堿(monostearoylphosphatidylcholine,MSPC,批號: B70309,純度:99.1%)、甲氧基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(monomethoxypolyethyleneglycol-distearoyl phosphatidylethanlamine,mPEG-DSPE,批號:K0986,純度:99.8%)、蛋黃卵磷脂(egg phosphatidylcholine, EPC,批號:108072-3,純度:98.6%),二硬脂酰磷脂酰甘油(distearoyl phoaphatidyl glycerol,DSPG,批號: 1010902,純度:99.0%)均購自Avanti polar lipids公司,紫杉醇對照品(批號:100382-200701,純度: 99.6%)、三杉尖寧堿(雜質A,批號:100926-200701)、10-去乙酰基7-表紫杉醇(雜質B,批號:100925-200701)及7-表紫杉醇(雜質C,批號:100927-200701)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇為色譜純,其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 LTSLP的制備 采用薄膜分散法制備LTSLP。分別稱取處方量的DPPC、MSPC、mPEG-DSPE、DSPG、EPC及紫杉醇置于茄形瓶中,加入適量三氯甲烷溶解,然后在抽真空條件下旋轉蒸發除去有機溶劑,以形成磷脂膜;向磷脂膜中加入10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0),在60℃條件下水化30 min,所形成的混懸液在氮氣流下經200 nm聚碳酸酯膜均質擠出即得LTSLP[6]。

2.2 LTSLP質量研究

2.2.1 性狀 所制備的3批樣品均為略帶藍色乳光的半透明液體。

2.2.2 含量測定

2.2.2.1 檢測方法 取LTSLP適量,置于50 mL量瓶,加甲醇-冰醋酸(400∶1)使溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取10 μL注入液相色譜儀,進行分析;另取紫杉醇對照品適量,精密稱定,同法測定。按外標法以峰面積計算其中紫杉醇的含量[7]。

HPLC參數:流動相為乙腈-水(30∶70,V/V);流速1.0 mL·min-1;色譜柱:Venusil XBP-C8(4.6 mm× 250 mm,5 μm);檢測波長227 nm;柱溫25℃;進樣量10 μL。

2.2.2.2 方法學驗證 ①專屬性:分別配制空白輔料及紫杉醇對照品的甲醇-冰醋酸(400∶1)溶液作為對照溶液,按照“2.2.2.1”項方法考察紫杉醇含量檢測方法的專屬性。結果表明,紫杉醇峰形良好,空白輔料不干擾其測定,說明本色譜方法的專屬性良好。

②線性關系:取紫杉醇對照品適量,精密稱定,用甲醇-冰醋酸(400∶1)溶解并稀釋至刻度,配制成濃度約為0.4 mg·mL-1的標準儲備液,然后分別稀釋成濃度約為60,80,100,120,140,160,180 μg·mL-1的系列溶液,照“2.2.2.1”中方法檢測,繪制標準曲線。結果表明,紫杉醇峰面積與濃度間的線性回歸方程為:Y= 465 684X+878 444,r=0.999 8,說明紫杉醇在60.39～181.17 μg·mL-1范圍內峰面積與濃度呈良好的線性關系。

③回收率:取紫杉醇對照品適量精密稱定,用甲醇-冰醋酸(400∶1)溶解并稀釋至刻度,制備濃度約為0.5 mg·mL-1的標準儲備液;另取處方量的空白輔料置于量瓶中,精密加入標準儲備液適量,配制成濃度分別為96 μg·mL-1(80%)、120 μg·mL-1(100%)、144 μg·mL-1(120%)的供試液,每個濃度平行配制3份;另平行配制濃度為120 μg·mL-1的對照溶液2份。照“2.2.2.1”項方法檢測,計算回收率。結果表明,各樣品的回收率均在98%～102%之間,高、中、低濃度的平均回收率分別為100.20%,98.45%, 98.88%,RSD為0.94%,均符合要求。

④重復性和精密度:精密量取LTSLP適量,加甲醇-冰醋酸(400∶1)溶解并稀釋至刻度,配制成濃度約為120 μg·mL-1的供試液,平行制備6份,照“2.2.2.1”項方法檢測,計算樣品中主藥含量及其RSD。結果表明,6份樣品的含量在95.60%～99. 79%之間,RSD為1.69%,表明方法的重復性良好。

照重復性實驗方法,改變檢測時間、分析人員及檢測儀器,測定LTSLP中紫杉醇的含量,計算重復性及中間精密度實驗中共12份樣品的含量及其RSD。結果表明,12份樣品的含量在95.26%～99.79%之間, RSD為1.53%,表明方法的中間精密度良好。

⑤溶液穩定性實驗:精密量取LTSLP適量,用甲醇-冰醋酸(400∶1)配制成濃度約為120 μg·mL-1的供試液,室溫避光保存分別于0,0.5,1,1.5,2,4 h照“2.2.2.1”項方法檢測。結果表明,放置不同時間后紫杉醇峰面積的RSD為1.08%,說明樣品溶液在室溫避光條件下放置4 h穩定。

綜合以上結果,該含量測定方法準確可靠,可用于LTSLP中紫杉醇的含量測定。

2.2.2.3 自制樣品中紫杉醇含量的檢測 分別對3批LTSLP中紫杉醇的含量進行檢測。結果表明,3批樣品中紫杉醇的含量分別為100.5%,97.5%及104.0%,均在90.0%～110.0%之間。

2.2.3 有關物質檢測

2.2.3.1 檢測方法 取LTSLP適量,加入甲醇-冰醋酸-三氯甲烷(400∶1∶100)混合溶液適量破膜,渦旋使之溶解,定容后搖勻,用孔徑0.45 μm有機膜濾過,制備成濃度約為0.5 mg·mL-1的供試液,按照含量測定方法進行有關物質檢測[7]。

2.2.3.2 方法學驗證 ①專屬性:配制空白溶劑及空白輔料溶液,按照有關物質檢測方法檢測;另取LTSLP、空白輔料以及空白溶劑適量置10 mL量瓶,分別于0.5 mol·L-1鹽酸(HCl)、0.5 mol·L-1氫氧化鈉(NaOH)、30%過氧化氫(H2O2)、強光[(4 500± 500)lx]以及100℃條件下放置不同時間,使紫杉醇的降解程度為10%～30%,加入甲醇-冰醋酸-三氯甲烷(400∶1∶100)混合溶液溶解并定容,按照有關物質檢測方法進行檢測。結果顯示,空白溶劑及空白輔料不干擾紫杉醇及其有關物質的測定;LTSLP經強酸、強堿、氧化、光照及高溫破壞后,所產生的降解產物與主藥以及降解產物之間均能良好分離,空白輔料及空白溶劑均不影響主藥以及降解產物的測定,說明本方法專屬性良好。

②系統適用性:取紫杉醇、雜質A、雜質B和雜質C對照品適量,用甲醇-冰醋酸-三氯甲烷(400∶1∶100)混合溶液溶解并稀釋制成約含0.5 mg·mL-1紫杉醇、2.5 μg·mL-1雜質A、2.5 μg·mL-1雜質B和2.5 μg·mL-1雜質C的溶液,作為系統適用性供試溶液。照有關物質檢測方法檢測。結果表明,紫杉醇及各已知雜質峰之間的分離度均>2.51,理論板數均> 14 280,且重復進樣6次,各峰面積的RSD均＜0.52%,說明本方法的系統適用性良好。

③靈敏度:精密量取紫杉醇、雜質A、雜質B和雜質C對照品適量,用甲醇-冰醋酸-三氯甲烷(400∶1∶100)混合溶液溶解并稀釋至不同濃度,照有關物質測定方法檢測,測定紫杉醇及各已知雜質的檢測限和定量限。結果表明,紫杉醇、雜質A、雜質B和雜質C的檢測限分別為1.5,1.5,1.5,3 ng,定量限分別為4,4, 4,11 ng。

綜合以上結果,該有關物質測定方法專屬性好,靈敏度高,可用于LTSLP中紫杉醇的有關物質測定。

2.2.3.3 自制樣品有關物質的檢測 分別對3批自制LTSLP中的有關物質進行檢測,結果表明,3批樣品中雜質A的含量分別為0.22%,0.23%及0.21%,其他最大單個雜質的含量分別為0.29%,0.25%及0.26%,總雜質的含量分別為0.82%,0.71%及0.75%。《中華人民共和國藥典》2010年版中收載了紫杉醇相關制劑,要求雜質Ⅰ(雜質Ⅰ峰面積乘以校正因子1.26)與其他單個雜質均不得超過0.5%,各雜質之和不得超過2.0%,因此自制LTSLP的有關物質符合《中華人民共和國藥典》2010年版要求。

2.2.4 溶血磷脂MSPC的檢測

2.2.4.1 檢測方法 取LTSLP適量,置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,采用HPLC-CAD法測定溶血磷脂含量。HPLC參數:流動相A為甲醇,流動相B為0.1 moL·L-1醋酸胺緩沖液(pH4.8),流速1 mL·min-1,色譜柱為Vensuil XBP C8(4.6 mm× 250 mm,5 μm),柱溫30℃,進樣量10 μL,洗脫方法為梯度洗脫,洗脫程序見表1。Corona檢測器參數:氣源:氮氣;工作氣壓:35 psi;濾波時間參數:低;滿量程輸出范圍:200pA。

表1 溶血磷脂含量測定的梯度洗脫程序Tab.1 Gradientelutionprogramforcontent determination of MSPC

2.2.4.2 方法學驗證 ①專屬性:分別配制DPPC、MSPC、mPEG-DSPE、DSPG、EPC及紫杉醇對照品的甲醇溶液作為對照溶液,按照“2.2.4.1”項方法考察溶血磷脂的專屬性。結果見圖1。由圖1可知,溶血磷脂(MSPC)的出峰時間合理,峰形良好,且MSPC與相鄰峰的分離度均>3,其他物質不干擾MSPC的測定,說明本色譜方法的專屬性良好。

②靈敏度:取一定濃度的MSPC標準溶液,用甲醇倍比稀釋后,按照“2.2.4.1”方法檢測,考察檢測限和定量限,結果見圖2。結果表明,MSPC的檢測限和定量限分別為4和12 ng。

1.MSPC;2.紫杉醇圖1 MSPC(A)及TSLP(B)的HPLC色譜圖1.MSPC;2.paslitaxelFig.1 HPLC chromatagrams of MSPC(A)and TSLP (B)

圖2 MSPC的檢測限(A)及定量(B)限色譜圖Fig.2 Chromatagrams of MSPC at the limits of detection(A)and quantification(B)

③線性關系考察:精密稱取MSPC適量置于量瓶中,以甲醇溶解定容后配制成濃度約為100 μg·mL-1的儲備液,分別稀釋成濃度為1.5,10,20,30及50 μg ·mL-1標準溶液,按照“2.2.4.1”方法檢測,繪制標準曲線。結果MSPC峰面積與濃度的線性回歸方程為Y=16 087X+10 895,r為0.999 8,說明MSPC在1.5～50.0 μg·mL-1范圍內峰面積與濃度線性關系良好。

④重復性:精密吸取LTSLP適量至50 mL量瓶,用甲醇破膜溶解,配制成MSPC濃度約為30 μg·mL-1的溶液,平行配制6份,按照“2.2.4.1”項方法檢測。結果表明,實測MSPC含量平均為1.73 mg·mL-1,6份樣品測定結果的RSD為1.77%,說明方法的重復性良好。

⑤回收率:分別按處方比例精密稱取除MSPC外的原輔料置100 mL量瓶,以甲醇溶解后定容,作為空白輔料溶液;精密吸取MSPC對照溶液至相應比例的空白輔料溶液中,配制濃度分別為24 μg·mL-1(80%)、30 μg·mL-1(100%)、36 μg·mL-1(120%)的供試液,每個濃度平行配制3份;另平行配制濃度為30 μg·mL-1的MSPC對照溶液2份;按照“2.2.4.1”項下方法檢測,考察方法的回收率。結果各樣品的回收率均在98%～102%,高、中、低濃度的平均回收率分別為101.63%,99.00%,101.04%,RSD＜2%,符合要求。

綜合以上結果,該溶血磷脂測定方法準確、可靠、靈敏度高,可用于LTSLP中溶血磷脂的檢測。

2.2.3.3 自制樣品中溶血磷脂的含量檢測 分別對3批自制LTSLP中的溶血磷脂進行檢測。結果表明,3批樣品中的溶血磷脂MSPC的量分別為1.71,1.73及1.69 mg·mL-1。《英國藥典》2010年版丙泊酚注射劑標準中規定溶血磷脂限度不得大于2 mg·mL-1[8],參照這一標準,本品中溶血磷脂量低于2 mg·mL-1,符合《英國藥典》2010年版要求。

2.2.3.4 體外溶血性考察 取兔耳緣靜脈血10 mL,加入玻璃珠振搖10 min后,加入10倍量5%葡萄糖溶液,搖勻,3 000 r·min-1離心5 min(r=5 cm),除去上清液,所得紅細胞沉淀繼續用5%葡萄糖溶液洗滌至上清液不顯紅色,離心,棄去上清液,得紅細胞。取紅細胞2 mL,用5%葡萄糖溶液配成2%混懸液100 mL,備用。

取潔凈試管5只,1～3號管作為供試品管,4號管為陰性對照管,5號管為陽性對照管。根據LTSLP的臨床應用方案,以稀釋5倍后的LTSLP為樣品溶液,即:1～3號管中加入用5%葡萄糖溶液稀釋5倍后的LTSLP懸液2.5 mL,4號管中加入5%葡萄糖溶液2.5 mL,然后向1～4號管中分別加入2%紅細胞混懸液2.5 mL,搖勻,備用。5號管中加入2%紅細胞混懸液2.5 mL后,3 000 r·min-1離心5 min(r=5 cm),吸取上層無色溶液1.5 mL后,加入純化水4 mL,搖勻,備用。將各試管置(37±0.5)℃水中溫育3 h, 3 000 r·min-1離心5 min(r=5 cm)后,取適量上清液,稀釋后于波長398 nm處測定吸光度,計算溶血百分率[9]。

結果3批樣品溶血百分率分別為2.67%,3.12%和2.54%,說明本品基本不引起溶血作用。

3 討論

溶血磷脂可以增加分子滲透、殺菌、溶血以及藥物親和性等[5],這使得溶血磷脂具有誘使細胞形狀改變、促進細胞融合、引起溶血以及改變細胞滲透性等特點[10]。YEAGLE和MARTIN等[10-11]研究結果證明,僅在高濃度下溶血磷脂才會導致細胞溶血,低濃度的溶血磷脂能夠抑制細胞膜融合,這可能與低濃度溶血磷脂可誘使磷脂脂質體呈交插脂雙層結構而抑制膜融合有關。

本研究在LTSLP中加入了少量溶血磷脂MSPC,以實現在相變溫度下藥物迅速釋放的目的。為進一步控制溶血磷脂的含量,避免在該熱敏脂質體貯存及使用過程中溶血磷脂量超標,筆者在本實驗中建立了檢測溶血磷脂含量的方法。目前用于測定磷脂組成的方法中,HPLC法以操作簡便、耗時少、成本低等特點成為磷脂分析的主流方法,所采用的檢測器多為紫外檢測器(ultraviolet detector,UV)、紅外檢測器(infrared detector,IR)、蒸發光散射檢測器(evaporative light scattering detector,ELSD)和電霧檢測器(charged aerosol detector,CAD)。采用UV及IR時,磷脂的檢測靈敏度低,基線不穩定[12];ELSD和CAD屬于新型檢測器,兩者均能消除梯度洗脫和流動相造成的分析檢測方面的不良影響。CAD作為一種獨特的通用檢測技術,不同于ELSD檢測器響應值與組分質量的對數關系,更便于計算,且具有更高的靈敏度和更好的重復性[13]。筆者在本實驗中利用HPLC-CAD建立了一種檢測LTSLP中溶血磷脂含量的方法,流動相采用了緩沖鹽-有機溶劑體系,使得基線更為平穩,使其靈敏度提高了將近20倍[14-15]。

長循環熱敏脂質體屬于一種新型藥物遞送載體,目前尚無上市產品,其質量控制無成熟標準可供參考。尚需進一步完善有關質量控制指標,如脂質體電位、脂質體的包封體積、體外釋放行為、滲透性以及光散射指數等。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.024

Preparation and Quality Control of Thermo-sensitive Paclitaxel Liposomes

LI Zhi-ping1,ZHAO Xi-qing1,2,ZHAO Shi-qing1,2,ZHANG Hui1,LIU Yan1,XIAO Ruo-lei2
(1.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China;2.Department of Pharmacy,Hubei University of Science and Technology,Xianning 437100,China)

ObjectiveTo prepare long-circulating temperature-sensitive liposomes with paclitaxel(LTSLP),develop methods for determination of paclitaxel,related substances and monostearoyl phosphatidylcholine(MSPC)in LTSLP,and the haemolysis of LTSLP invitro.MethodsHPLC-UV methods for paclitaxel content and related substances and HPLC-CAD method for MSPC in LTSLP were established and validated.Spectrophotometric method was used to determine hemolysisin vitro.ResultsThere was a good linear relationship between peak area and concentration within the range of 60.39-181.17 μg·mL-1.Recovery and precision of the method for determination of paclitaxel content met the requirements.Specificity,sensitivity,and system suitability for related substances were consistent with requirements.There was a good linear relationship between peak area and concentration within the range of 1.5-50.0 μg·mL-1for the determination of MSPC with good specificity,sensitivity and recovery. Paclitaxel contents in three batches of self-prepared LTSLP were between 90.0%and 110.0%,single related substances were below 0.5%and total impurities were below 2.0%.There was almost no hemolysis invitro.ConclusionThe methods for determining paclitaxel content,related substances and haemolysis can be used to assess the quality of LTSLP.Self-produced LTSLP consistently meet the quality standards.

Thermo-sensitive liposomes with paclitaxel;Haemolysis;HPLC;Quantity control

R97;TQ460.6

B

1004-0781(2014)11-1486-05

2013-11-02

2013-12-05

李志平(1980-),女,河南濮陽人,助理研究員,博士,研究方向:緩控釋制劑。電話:010-66932654,E-mail:dearwood2010@126.com。

肖若蕾,女,副教授,碩士生導師,研究方向:緩控釋制劑。電話:0715-8272135,E-mail:yxyxrl@163.com。