高效液相色譜法測定甲磺酸伊馬替尼脂質體含量及有關物質

方夏琴,劉盟盟,張秀立,吳一飛,鄭穩(wěn)生

(中國醫(yī)學科學院、北京協和醫(yī)學院藥物研究所,藥物傳輸技術及新型制劑北京市重點實驗室,北京 100050)

高效液相色譜法測定甲磺酸伊馬替尼脂質體含量及有關物質

方夏琴,劉盟盟,張秀立,吳一飛,鄭穩(wěn)生

(中國醫(yī)學科學院、北京協和醫(yī)學院藥物研究所,藥物傳輸技術及新型制劑北京市重點實驗室,北京 100050)

目的 建立高效液相色譜(HPLC)法,檢測甲磺酸伊馬替尼脂質體的含量及有關物質。方法Kromasil C18柱,流動相A為辛烷磺酸鈉溶液-甲醇(42∶58);流動相B為辛烷磺酸鈉溶液-甲醇(4∶96);梯度洗脫,流速為1.2 mL·min-1,柱溫室溫,檢測波長268 nm。結果在選定的色譜條件下,甲磺酸伊馬替尼專屬性良好,在線性范圍1～100 μg·mL-1內線性關系良好,r=0.999 1(n=5)。結論該方法用于檢測甲磺酸伊馬替尼脂質體的含量及有關物質準確、靈敏、可靠。

伊馬替尼,甲磺酸;含量測定;有關物質;色譜法,高效液相

甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate,商品名: Glivec,格列衛(wèi))是一種口服的新型酪氨酸激酶抑制藥。目前已知的主要不良反應包括血液學毒性和非血液學毒性[1-6]。將甲磺酸伊馬替尼制成脂質體,可減少甲磺酸伊馬替尼不良反應,增加治療應用[7]。

筆者在本實驗中建立測定甲磺酸伊馬替尼脂質體含量及有關物質的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法,實驗表明該方法專屬性強,準確、靈敏,操作簡單。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100系列高效液相色譜儀、ChemStation色譜工作站;旋轉蒸發(fā)儀(EYELA N-1000,日本東京理化器械株式會社);高壓勻質機(Niro NS2006L,意大利GEA Niro Soavi公司);葡聚糖凝膠G-50顆粒,葡聚糖凝膠柱(40 cm×16 cm)(稱取葡聚糖凝膠顆粒5 g,純化水浸泡24 h,濕法裝柱,待用)。

1.2 試藥 大豆卵磷脂(soybean phosphatidylcholine, SPC,北京化學試劑公司,生化試劑,批號:100708,純度:98%);膽固醇(cholesterol,Chl,北京化學試劑公司,生化試劑,批號:101012,純度:98%);甲磺酸伊馬替尼標準品(加拿大TRC公司標準品,含量>99%,批號:FI10812);甲磺酸伊馬替尼原料藥(北京華威銳科化工有限公司,含量>98.0%,批號:100302);甲磺酸伊馬替尼脂質體(中國醫(yī)學科學院藥物研究所自制,批號:110501,濃度:1.5 mg·mL-1);曲拉通X-100 (北京化學試劑公司,試劑級,使用時用乙醇配制成10%的曲拉通溶液,批號:091213,純度≥98%)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(150 mm× 4.6 mm,5 μm,Akzo Nobel公司);流動相A為辛烷磺酸鈉溶液(取辛烷磺酸鈉7.5 g,加水800 mL使溶解,用10%磷酸溶液調節(jié)pH至2.5,加水稀釋至1 000 mL)-甲醇(42∶58);流動相B為辛烷磺酸鈉溶液(取辛烷磺酸鈉7.5 g,加水800 mL使溶解,用10%磷酸調節(jié)pH至2.5,加水稀釋至1 000 mL)-甲醇(4∶96);室溫,流速1.2 mL·min-1;檢測波長268 nm;進樣量:10 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相時間梯度表Tab.1 Gradient program of mobile phase %

2.2 系統(tǒng)適應性實驗 溶劑1:甲醇-0.1 mol·L-1鹽酸(6∶4)。標準品的溶液配制:取甲磺酸伊馬替尼標準品36 mg,精密稱定,置于50 mL量瓶,加溶劑1溶解并定容,搖勻。取續(xù)濾液10 μL注入色譜儀,連續(xù)進樣6次,主峰面積的相對標準偏差不得大于2.0%,甲磺酸伊馬替尼標準品溶液色譜圖見圖1。

1.甲磺酸伊馬替尼圖1 甲磺酸伊馬替尼標準品溶液液相色譜圖1.Imatinib mesylateFig.1 HPLCchromatogramofImatinibmesylate reference solution

計算甲磺酸伊馬替尼主峰峰面積和保留時間的RSD,分別為0.34%(n=6)和0.76%(n=6),符合相關要求,系統(tǒng)適應性良好。

2.3 專屬性實驗 吸取空白脂質體1 mL置于25 mL量瓶,加入甲醇溶解破乳后,以溶劑1稀釋定容,振搖破乳,即得空白脂質體破乳液樣品。

吸取空白脂質體1 mL于25 mL量瓶,以適量甲醇破乳后,加入70 μg·mL-1甲磺酸伊馬替尼標準品溶液稀釋定容,振搖破乳,即得含藥空白脂質體樣品。

吸取甲磺酸伊馬替尼脂質體1 mL置25 mL量瓶中,加入甲醇溶解破乳后,以溶劑1稀釋定容,振搖破乳,即得甲磺酸伊馬替尼脂質體破乳液樣品。

將上述溶液過濾后置進樣瓶中,取10 μL進樣,記錄色譜圖,見圖2～4。

圖2 空白脂質體破乳液液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of demulsification solution of liposome

1.甲磺酸伊馬替尼圖3 空白脂質體與甲磺酸伊馬替尼標準品溶液的液相色譜圖1.Imatinib mesylateFig.3 HPLC chromatogram of liposome and Imatinib mesylate reference

1.甲磺酸伊馬替尼圖4 甲磺酸伊馬替尼脂質體破乳液液相色譜圖1.Imatinib mesylateFig.4 HPLC chromatogram of demulsification solution of imatinib mesylate

2.4 線性關系考察 用溶劑1配制500 μg·mL-1甲磺酸伊馬替尼標準品儲備液,再用溶劑1稀釋此儲備液制備成濃度為1,5,10,50,100 μg·mL-1對照品溶液,分別進樣10 μL,測定峰面積。以峰面積(A)為縱坐標,對照品濃度(C,μg·mL-1)為橫坐標,進行線性回歸,回歸方程為:A=30.18C+8.689,r=0.999 1(n=5)。表明甲磺酸伊馬替尼溶液濃度在1～100 μg·mL-1范圍內,與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 回收率實驗 精密移取9份1 mL空白脂質體,分別置9個10 mL量瓶中,分成3份,第1份各加入50 μg·mL-1甲磺酸伊馬替尼標準品溶液8 mL(即含藥40 μg·mL-1),第2份各加入50 μg·mL-1甲磺酸伊馬替尼標準品溶液9 mL(即含藥45 μg·mL-1),第3份各加入100 μg·mL-1甲磺酸伊馬替尼標準品溶液6 mL(即含藥60 μg·mL-1),再用甲醇溶解振搖破乳后以溶劑1稀釋到刻度,進樣10 μL,記錄色譜峰面積,計算得回收率分別為101.3%,101.9%,100.4%,平均RSD為1.7%。由此可見,脂質體處方中的輔料對測定基本無干擾。

2.6 方法重復性實驗 取標準品適量,精密稱定,加溶劑1制成每毫升中含50 μg的溶液作為重復性樣品溶液。精密量取10 μL,注入液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,以峰面積計算得RSD為0.24%(n=6)。

2.7 精密度實驗 取本品適量,精密稱定,加溶劑1制成為每毫升含50 μg的溶液作為供試品溶液。精密量取10 μL,注入液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,以峰面積計算得RSD為0.51%(n=6)。

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性實驗 取甲磺酸伊馬替尼脂質體適量,甲醇破乳后以溶劑1稀釋至成每毫升含50 μg的溶液,分別在0,2,4,8,12,24 h進樣,記錄色譜圖,測定峰面積得RSD為0.36%,表明本品室溫放置在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.9 檢測限和定量限 取“2.4”項溶液逐級稀釋,按S/N≈10測得甲磺酸伊馬替尼的定量限為0.06 μg·mL-1,按S/N≈3測得甲磺酸伊馬替尼的檢測限為0.02 μg·mL-1。

2.10 含量測定 取甲磺酸伊馬替尼脂質體4 mL置100 mL量瓶中,甲醇適量破乳后以溶劑1稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。精密量取10 μL注入液相色譜儀,記錄圖譜。另取甲磺酸伊馬替尼標準品,用溶劑1溶解,并稀釋至濃度為0.06 mg·mL-1,同法測定,按外標法以峰面積計算出脂質體中甲磺酸伊馬替尼的含量,結果4批產品的含量分別為76.32%,75.10%, 80.62%,78.79%,表明均一性較好。

2.11 有關物質測定 取甲磺酸伊馬替尼脂質體40 mL置100 mL量瓶,甲醇適量破乳后用溶劑1稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。取供試品溶液1 mL置100 mL量瓶,用溶劑A稀釋至刻度,作為1%對照溶液,各精密量取10 μL注入液相色譜儀,調整儀器靈敏度,使主成分峰的峰高為記錄儀滿量程的20%,記錄色譜至主峰保留時間的2倍。供試品溶液中各雜質峰的峰面積之和,不得大于對照溶液主峰的峰面積(總雜質＜1%),結果4批產品的有關物質總雜質分別為0.24%,0.22%, 0.22%,0.21%。

3 討論

采用本方法能準確測得甲磺酸伊馬替尼的含量和有關物質,專屬性良好,線性關系、回收率、穩(wěn)定性均能滿足要求。甲磺酸伊馬替尼脂質體在本方法檢測條件下,含量達70%,有關物質亦能滿足要求。

本實驗曾使用了多組流動相進行篩選,采用的流動相主峰分離度較好,峰形尖銳,保留時間適中,能滿足分析的要求。與其他方法比較,本法將梯度波動遠離主藥保留時間,使得溶劑峰不干擾主峰的測定。

經本方法測得的甲磺酸伊馬替尼脂質體含量較高,制劑的有關物質能得到有效控制。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.026

Determination of Imatinib Mesylate Liposome and Related Substances by HPLC

FANG Xia-qin,LIU Meng-meng,ZHANG Xiu-li,WU Yi-fei,ZHENG Wen-sheng
(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing City Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulations,Beijing 100050,China)

ObjectiveTo establish a method for determination of imatinib mesylate liposome and related substances.MethodsThe liquid chromatography was carried out on a Kromasil C18column.The mobile phase A consisted of methanoloctane sulfonate solution(42∶58).The mobile phase B consisted of methanol-octane sulfonate solution(4∶96).The flow rate of gradient elution was 1.2 mL·min-1.The detection wavelength was 268 nm.The column temperature was room temperature.ResultsThe intermediates and degraded substances could be seperated under the selected chromatographic conditions.Imatinib mesylate showed a good linear relationship within 1-100 μg·mL-1,r=0.999 1(n=5).ConclusionThe method is specific, accurate,sensitive,and simple,and can be used for quality control of imatinib mesylate liposome.

Imatinib,mesylate;Determination;Related substances;HPLC

R979.1;R927.2

B

1004-0781(2014)11-1495-03

2013-09-09

2013-10-22

方夏琴(1986-),女,安徽潛山人,碩士,主要研究方向:藥物傳輸技術與新型制劑。電話:010-63165233,E-mail:fangxiaqin@163.com。

鄭穩(wěn)生(1966-),男,安徽潛山人,研究員,博士,主要研究方向:藥物傳輸技術與新型制劑。電話:010-63165233,E-mail:zhengwensheng@imm.ac.cn。