復方刺梨合劑高效液相色譜指紋圖譜研究

蔣正立,戴丹平,林忠

(浙江省臺州醫院藥劑科,臨海 317000)

復方刺梨合劑高效液相色譜指紋圖譜研究

蔣正立,戴丹平,林忠

(浙江省臺州醫院藥劑科,臨海 317000)

目的 建立復方刺梨合劑的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜研究方法。方法采用HypersilC18(4.6 mm× 250 mm,5 μm)色譜柱,流動相為6%甲醇(pH3.05)-甲醇進行梯度洗脫,檢測波長270 nm,流速1.0 mL·min-1,柱溫30℃,檢測10批復方刺梨合劑,建立指紋圖譜。結果以維生素C為參照物峰,指紋圖譜標記了14個共有峰,10批相似度以平均數和中位數計算均>0.99。結論該方法具有良好的精密度、重復性、穩定性,可用于復方刺梨合劑質量的綜合評價。

刺梨合劑,復方;色譜法,高效液相;指紋圖譜

復方刺梨合劑是浙江省臺州醫院醫院制劑,為刺梨和蒼術的復方制劑,具有健脾燥濕、消食和胃等功效,臨床用于治療食積不化、胃脘脹滿、泄瀉等[1]。《浙江省醫療機構制劑規范》(2005年版)雖有收載復方刺梨合劑質量標準(含性狀、鑒別和檢查項目),但其質量標準較低。查閱復方刺梨合劑質量控制的相關文獻[2-9],其質量標準僅對合劑中某一成分的含量進行控制[4],不能全方位表征其內在質量,故很難確保復方刺梨合劑的質量。為更好地控制制劑質量,為其物質基礎研究提供參考,筆者對復方刺梨合劑進行高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國Waters高效液相色譜儀(Waters717進樣器,1525泵與2487檢測器,Breeze數據處理系統),TGL-16C離心機(上海安亭科學儀器廠),PHS-3C型pH計(上海精密科學儀器有限公司),SB25-12D超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試劑與藥品 維生素C對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:100425-200702,含量:100.0%),刺梨對照藥材(浙江省食品藥品檢驗研究院,批號: 20070820,經浙江省臺州醫院王美萍副主任中藥師鑒定為Rosa roxbughiiTratt.的果實),蒼術對照藥材(中國食品藥品檢定研究院,批號:120932-200405,經浙江省臺州醫院王美萍副主任中藥師鑒定為茅蒼術A.lancea(Thunb.)DC.的干燥根莖),復方刺梨合劑(浙江省臺州醫院制劑室自制,批準文號:浙藥制字Z20100038,批號:130107,121105,121011,120913, 120801,120702,120628,120504,120419,120314, 120209,規格:每瓶250 mL);甲醇為色譜純,水為重蒸純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil C18(4.6 mm× 250 mm,5 μm);流動相:6%甲醇(pH3.05)A-甲醇B,進行梯度洗脫(A:0～16 min,100%;16～46 min, 100%→59.4%;46～51 min,59.4%;51～56 min, 59.4%→38.7%;56～84 min,38.7%→17%)檢測波長:270 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:30℃;進樣量:20 μL。

2.2 參照峰的選擇 維生素C為復方刺梨合劑中有效成分,維生素C的HPLC測定技術比較成熟,在色譜圖中峰面積較大,出峰時間適中且穩定,故選維生素C作為本研究的參照峰。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取維生素C對照品適量精密稱定,加水,制成每毫升含維生素C1.0 mg的對照品溶液。當日配制,2～8℃保存,臨用時用流動相稀釋成不同濃度的標準系列。

2.3.2 對照藥材溶液的制備

2.3.2.1 刺梨原汁的制備 取刺梨對照藥材1.0 g,加水50 mL,加熱至沸并保持微沸30 min,放冷,濾過并冷卻至0℃,經離心(9 000 r·min-1,離心15 min,離心半徑6.0 cm,)后超濾,濾液低溫真空濃縮,即可。

2.3.2.2 蒼術原汁制備 取蒼術對照藥材1.0 g,加藥材3倍量水煎煮1 h,取煎液后加藥材2倍量水再煎煮1 h,合并兩次煎液,濾過,濾液靜置24 h,取上清液濃縮至相對密度1.15～1.20(60℃),即可。

2.3.3 供試品溶液的制備 將樣品搖勻,離心(9 000 r·min-1,離心15 min,離心半徑6.0 cm),取其上清液1 mL,置50 mL量瓶中,加水稀釋并定容搖勻,即可。

2.4 方法學驗證

2.4.1 精密度實驗 取同一批號(批號:120702)制劑的供試品溶液,連續進樣6次進行測定,考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積比值的一致性,結果各共有峰相對保留時間的RSD為0.13%～0.17%,相對峰面積的RSD為1.92%～2.90%,表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性實驗 取同一批(批號:120702)制劑的供試品溶液,分別在0,1.5,3,6,9,12,18,24 h進樣,測定,考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積比值的一致性,結果顯示各共有峰相對保留時間的RSD為0.11%～0.89%,相對峰面積的RSD為1.36%～2.83%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性實驗 取同一批(批號:120702)樣品,按照供試品溶液的制備方法制備5份,依次進行測定,考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積比值的一致性,結果各共有峰相對保留時間的RSD為0.08%～ 2.48%,相對峰面積的RSD為1.23%～2.95%,RSD＜3.00%,表明本方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.5.1 指紋圖譜的建立 取10批復方刺梨合劑樣品,分別按“2.3.3”項供試品溶液制備方法進行處理,再按“2.1”項條件進行HPLC指紋圖譜測定,根據10批供試品溶液HPLC提供的相關參數,以維生素C為參照峰,其相對保留時間約為1.000 0,標記了復方刺梨合劑指紋圖譜中14個共有(特征)峰,其相對保留時間和相對峰面積見表1,2。

經分析表1、表2數據,發現10批樣品的HPLC指紋圖譜中各批號樣品間共有指紋峰的相對保留時間比較吻合,但部分批號個別峰相對峰面積波動較大,認為可能是生產所用原料各批次間存在差異,如原料產地、采收、加工等不同導致了原料中各組分的含量存在差異所致。

2.5.2 指紋圖譜相似度評價 將10批樣品的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A版),設定匹配模板,進行譜峰自動匹配,生成對照指紋圖譜(圖1),進行相似度評價。樣品與對照圖譜的相似度以平均數計算分別為0.997,0.991,0.994, 0.991,0.998,0.994,0.999,0.999,1.000,1.000,以中位數計算分別為0.997,0.991,0.994,0.991,0.998, 0.999,0.999,1.000,1.000,1.000,均>0.99。10批不同批次復方刺梨合劑樣品指紋圖譜相似度均>0.99,圖譜確定共有峰14個,各峰分離良好。實驗表明,此法簡便、重復性好,所建指紋圖譜相似度較好,故筆者認為本色譜條件下建立的刺梨合劑HPLC指紋圖譜,能較好滿足復方刺梨合劑的質量控制。

2.5.3 拆方分析 按照“2.1”項色譜條件,分別測定刺梨對照藥材、蒼術對照藥材、維生素C的HPLC圖(圖2),并與復方刺梨合劑的指紋圖譜色譜峰一一對照,結果發現復方刺梨合劑樣品中4號峰的保留時間與蒼術對照藥材中1號峰相吻合,1～3和5～14號峰與刺梨對照藥材中1～13號峰相吻合,且1號峰的保留時間與維生素C吻合。其中1號峰不能完全和其他組分分離,但由于1號峰旁的其他組分的含量遠小于1號峰所代表的維生素C的含量,其峰高比>10倍,可將其他組分的峰當基線處理,完全符合理論。11號峰由3個峰構成,由于這3個峰不能完全獨立開來,所以就將它視作一個峰。其他的12個共有峰都能完全的獨立分開。

表1 10批樣品指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表2 10批樣品指紋圖譜共有峰的相對保留峰面積

圖1 復方刺梨合劑的HPLC指紋圖譜

3 討論

圖2 刺梨對照藥材、蒼術對照藥材、復方刺梨合劑HPLC指紋圖譜

{L-End}

3.1 流動相的選擇 復方刺梨合劑中含有多種化學成分[6],很難找到較理想的等度洗脫條件。本實驗根據文獻[2-9]和實驗條件分別采用了乙腈-水、甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀、甲醇-水等不同濃度、不同比例的等度和梯度洗脫條件進行了實驗,結果都不理想,雖然維生素C在0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀-甲醇(96∶4)條件下能從混合物中分離出來,但是由于鹽濃度太高,容易在梯度洗脫過程中使色譜柱堵塞,所以也不理想。最后發現用磷酸調6%甲醇pH到3.05能使維生素C理想分離出。分析時采用梯度洗脫,A相為6%甲醇(pH3.05),B相為甲醇,經比較洗脫條件,最后確定程序為A:0～16 min,100%;16～46 min,100%→59.4%;46～51 min,59.4%;51～56 min,59.4%→38.7%;56～84 min,38.7%→17%,得到滿意結果。

3.2 檢測波長的選擇 參考相關文獻報道[2-9]在258, 270,300,320 nm波長處對復方刺梨合劑中主要成分進行考察,結果顯示:①刺梨原汁在λ=258 nm下各組分吸收峰呈現較完全,而蒼術原汁在λ=258 nm下幾乎無吸收;②在λ=300 nm,320 nm下刺梨原汁吸收不完全;③在λ=270 nm下刺梨原汁雖吸收峰的分離度沒有在λ=258 nm處好,但是蒼術原汁在λ=270 nm下有一成分出峰,且分離度好。且復方刺梨合劑中的主要有效組分是刺梨,所以綜合上述情況,實驗選擇λ= 270 nm為檢測波長。

3.3 柱溫的選擇 對柱溫在25,30,35℃進行考察,結果顯示柱溫在30℃時,色譜分離時間短,分離效果好。

3.4 樣品處理方法的選擇 本實驗分別用孔徑為4.5 μm微孔濾膜、9 000 r·min-1(離心半徑Rmin= 3.7 cm,Rmax=6.0 cm)離心15 min分離同一批樣品得溶液,并將所得溶液稀釋50倍,在“2.1”項條件下進樣,測得HPLC圖,結果將色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A版)得各成分的峰面積RSD＜0.2%,且離心法操作簡單,所以本實驗采用離心法處理樣品。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.031

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蔣正立(1980-),男,浙江臨海人,主管藥師,學士,研究方向:醫院藥學。電話:0576-85199355,E-mail:jiangzl @tzhospital.com。