FW-04-806對HER2陽性胃癌細胞的抗腫瘤活性及其機制研究

張 敏，曹品容，吳群丹，孔應利，陳麗紅，羅燕梅，黃 維，3，許建華，2，葉 敏，2

（1.福建醫(yī)科大學藥學院，福建福州 350004；2.福建省天然藥物藥理學重點實驗室，福建福州 350004；3.福建省微生物研究所，福建福州 350007）

胃癌是全球第4大常見的癌癥，癌癥相關(guān)致死率在全球排名第2位［1］，在我國，胃癌的發(fā)生率居各癌癥之首。大約20%的胃癌患者HER2過表達［2］。人類表皮生長因子受體2（HER2）是表皮生長因子受體家族的成員之一，分子質(zhì)量185 ku，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體［3］。臨床上已出現(xiàn)多種HER2靶向藥物，然而，大多數(shù)起初對HER2靶向藥物有效的患者，最終都發(fā)生獲得性耐藥或二級耐藥，由此衍生出一系列對曲妥珠單抗耐藥的治療策略，其中之一就是熱休克蛋白90（Hsp90）抑制劑［4］。

Hsp90是高度保守的分子伴侶，通過消耗ATP，對細胞中眾多信號蛋白構(gòu)象成熟和功能穩(wěn)定進行調(diào)控［5］。眾多癌癥相關(guān)蛋白（包括HER2）的穩(wěn)定都需要Hsp90的參與，這使得它成為研究治療基因突變相關(guān)癌癥和克服靶向藥物耐藥的熱門靶點。因此，探索其他具有Hsp90抑制功能的藥物，對于治療HER2陽性胃癌和解決HER2靶向藥物的耐藥問題具有重要的意義。

FW-04-806是本課題組的合作單位，福建省微生物研究所從土壤鏈霉菌Streptomyces sp.FIM-04-806發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得的大環(huán)雙內(nèi)酯化合物［6］，經(jīng)過化學結(jié)構(gòu)鑒別確定FW-04-806與conglobatin同質(zhì)（Fig 1）。

Fig 1 Molecular formula and molecular weight of FW-04-806Molecular formula：C28 H33 N2 O；Molecular weight：498.62

本課題組前期通過研究FW-04-806對HER2陽性乳腺癌的抗腫瘤活性發(fā)現(xiàn)［7］，F(xiàn)W-04-806結(jié)合于Hsp90 N端，卻不影響ATP和Hsp90的結(jié)合及ATP水解酶的活性，能減弱Hsp90與CDC37的相互作用，降解HER2和Akt等Hsp90客戶蛋白，提示FW-04-806可能是一種新型的Hsp90抑制劑。本課題在此基礎(chǔ)上，從Hsp90功能抑制的角度研究FW-04-806對HER2陽性胃癌細胞的抗腫瘤活性及其作用機制，并探討FW-04-806與HER2酪氨酸酶抑制劑拉帕替尼（lapatinib）對HER2陽性胃癌細胞的聯(lián)合效果，為今后本課題組開發(fā)該藥作為新型Hsp90抑制劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大環(huán)雙內(nèi)酯化合物FW-04-806（HPLC純度＝98%）由福建省微生物研究所提供；Lapatinib購自Lc laboratories公司，藥物溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配成儲存液 10 mmol·L－1于 －20℃?zhèn)溆茫褂们敖鈨觯门囵B(yǎng)液稀釋成所需濃度。人胃癌細胞株NCI-N87購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；OE19購自中國廣州吉妮歐生物科技有限公司；AGS、SGC-7901由福建醫(yī)科大學臨床藥理研究所提供。MTT［3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽］購于美國 Sigma公司。HER2／ErbB、p-HER2／ErbB（Y1221／1222）、p-Akt、p44／42 MAPK（ERK1／2）、p-p44／42 MAPK（T202／Y204）（p-ERK）、caspase-3、cleaved caspase-3、Parp、cleaved Parp（Asp214）、CDC37均購自美國Cell Signaling Technology公司；Neu（C-18）（HER2）、Neu Antibody（24D2）FITC、Akt1（F-8）、β-actin（C4）、Hsp90（4F10）、Hsp70（W27）、Hsp27（G31）等均購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠／抗兔 IgG（二抗）、BCA蛋白定量試劑盒購于美國Pierce公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、流式凋亡檢測試劑盒均購自Roche公司。Protein A Mag sepharoseTM、磁力架、ECL化學發(fā)光顯影液購自GE healthy公司。FACSCantoII流式細胞儀購于BD公司；Image station 4000MM成像系統(tǒng)購于Carestream公司；電泳、轉(zhuǎn)膜儀為BIORAD公司產(chǎn)品。♂SPF級Balb／C裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：2007000566073。小鼠、兔超敏二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞株培養(yǎng)于含有胎牛血清（體積分數(shù)為 0.1）、青霉素（1×105IU·L－1）和鏈霉（100 mg·L－1）的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，NCI-N87使用Biochrome胎牛血清，OE19、AGS、SGC-7901使用 Hyclone胎牛血清，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 FITC染色法檢測細胞HER2表達 用不含EDTA的胰酶消化并收集對數(shù)生長期的NCI-N87、OE19、AGS、SGC-7901細胞各 1.8×106個，1 000 r·min－1離心5 min；PBS洗滌細胞后，每組中加入5 μl的Neu Antibody（24D2）FITC混勻，室溫下避光反應5～15 min，PBS洗滌細胞2次后，轉(zhuǎn)移入流式管中，4℃避光，冰上保存，60 min內(nèi)在流式細胞儀上檢測。

1.2.3 MTT法檢測 FW-04-806對NCI-N87、OE19、AGS、SGC-7901細胞增殖抑制作用 96孔培養(yǎng)板中每孔種植4×103個細胞，每孔180μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，使細胞貼壁后，實驗組分別加入不同濃度的藥物，對照組不加藥，另設(shè)空白孔組（只加培養(yǎng)基，無細胞），每組設(shè)3個復孔，作用48 h。然后每孔加入5 g·L－1的 MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，加入150μl DMSO溶解，培養(yǎng)箱孵育20 min后，用酶標儀（Thermo公司）在570 nm波長下測吸光度值（OD值）。結(jié)果用 Prism Graph軟件分析，繪制細胞存活率－濃度曲線，計算藥物IC50，實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 結(jié)晶紫染色法檢測FW-04-806對NCI-N87、OE19細胞集落形成能力的抑制作用 12孔板上每孔種植5×103個細胞，培養(yǎng)箱過夜貼壁，實驗組分別加入不同濃度的藥物，對照組加DMSO，每組設(shè)3個平行孔，每周更換新鮮藥液2次，作用10 d，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，加入適量甲醇，固定細胞5 min，PBS清洗2次，吸干水分，晾干后加入結(jié)晶紫染液（0.5 g吉氏染色素粉末，溶于50 ml甲醇與50 ml雙蒸水）覆蓋細胞層，染色10 min，用自來水沖洗掉后，再用雙蒸水沖洗細胞，顯微鏡下觀察計算集落數(shù)目。

1.2.5 碘化丙啶（PI）染色法檢測細胞周期 取對數(shù)生長期的NCI-N87、OE19細胞，調(diào)整細胞濃度為每孔9×105個細胞，接種到6孔板中，37℃培養(yǎng)箱過夜貼壁，設(shè)置對照組及加藥處理組。不同濃度的FW-04-806作用48 h，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，1 000 r·min－1離心 5 min，收集細胞后用0.5 ml PBS重懸，緩慢加入4.5 ml體積分數(shù)為0.75的乙醇中，邊滴邊輕輕搖勻，－20℃冰箱中放置24 h以上，離心棄去上層乙醇溶液，用PBS清洗1次，收集細胞后，0.5 ml PBS重懸，加入RNA酶使其終濃度為50 mg·L－1，37℃孵育 30 min，加入 PI染色液使其終濃度為50 mg·L－1，室溫避光染色30 min；轉(zhuǎn)移入流式管中，4℃避光，冰上保存，并在流式細胞儀上檢測，實驗結(jié)果采用Modifit軟件進行分析。

1.2.6 Annexin-V-FITC／PI雙染法檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的NCI-N87、OE19細胞，接種到6孔板中，每孔種1.8×106個細胞，37℃培養(yǎng)箱靜置過夜貼壁，設(shè)置對照組及加藥處理組。不同濃度的藥物作用48 h，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，1 000 r·min－1離心5 min；PBS洗滌細胞 2次后，用0.5 ml Binding Buffer重懸細胞；每組中加入5μl的Annexin-V-FITC混勻，再加入5μl的PI混勻；室溫下避光反應5～15 min，轉(zhuǎn)移入流式管中，4℃避光，冰上保存，60 min內(nèi)在流式細胞儀上檢測［8］。

1.2.7 體內(nèi)動物實驗

1.2.7.1 體內(nèi)異種移植瘤模型檢測FW-04-806對OE19腫瘤生長抑制作用 收集1×107個OE19細胞，0.2 ml PBS重懸，超凈臺內(nèi)于裸鼠左側(cè)背部皮下注射。腫瘤生長到一定大小后，無菌條件下解剖并取其瘤塊，將瘤塊剪成直徑約為2.0 mm左右的均勻小塊，用無菌套管針接種于裸鼠背部皮下，等腫瘤生長至100～200 mm3時，將裸鼠按瘤體積大小隨機分3組，每組6只。分組后次日開始每天灌胃給藥，低劑量組為50 mg·kg－1FW-04-806，高劑量組為200 mg·kg－1FW-04-806，陰性對照組為與實驗組等體積的空白溶劑（體積分數(shù)為0.1的乙醇、0.1的PEG 400、0.1的 Tween 80、0.7的生理鹽水）。最后一次給藥24 h后，將裸鼠脫頸椎處死，剝?nèi)×鰤K并稱重，計算各組瘤重均數(shù)及腫瘤生長抑制率。抑瘤率／%＝（1－給藥組平均瘤重／陰性對照組平均瘤重）×100%；腫瘤體積＝1／2×長徑×短徑2。

1.2.7.2 免疫印跡法檢測FW-04-806對OE19瘤塊細胞通路相關(guān)蛋白表達的影響 從稱重后的瘤塊剪下一粒黃豆大小的組織放入勻漿器內(nèi)，加入細胞裂解液勻碎研磨，轉(zhuǎn)入EP管，冷凍離心機4℃，12 000×g離心15 min，吸出上清，即為總蛋白，整個過程在冰上操作。BCA法蛋白定量后于98℃下蛋白變性，冷卻后－20℃保存，免疫印跡法檢測蛋白表達。

1.2.7.3 免疫組化檢測FW-04-806對OE19腫瘤組織Akt、HER2蛋白表達的影響 將稱重記錄后的瘤塊裝入包埋盒中，4%甲醛液固定，自動脫水機脫水后將組織包埋；置于冷卻機上冷卻后，用切片機切片，60℃恒溫烤片過夜，烘干的切片進行脫蠟和水化，使用酸性修復法進行抗原修復；加入3%H2O2孵育8 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，加入相應的一抗稀釋液室溫下孵育2 h，加二抗檢測試劑Ⅰ室溫下孵育20 min后，加二抗檢測試劑Ⅱ，室溫下孵育30 min，加入DAB底物混合液孵育5 min，PBS沖洗后蘇木精復染、脫水、透明、封片，正置顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.8 免疫印跡法檢測FW-04-806對HER2陽性胃癌細胞相關(guān)蛋白表達的影響 取對數(shù)生長期的NCI-N87和OE19細胞，在培養(yǎng)皿中種3×106個細胞，培養(yǎng)箱過夜貼壁，設(shè)置對照組及不同濃度的藥物處理組，作用24 h，收集細胞裂解液，BCA蛋白定量，98℃蛋白變性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，相應一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min，室溫下二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min，在Image station 4000MM成像系統(tǒng)上加入ECL發(fā)光底物進行曝光顯影。

1.2.9 免疫共沉淀法檢測FW-04-806對Hsp90／CDC37復合物的影響 取生長對數(shù)期的OE19細胞，每皿3×106個細胞，接種到10 cm的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱過夜貼壁，設(shè)置對照組及加藥處理組，作用24 h，收集細胞裂解液，BCA蛋白定量，用NP-40裂解液將對照組和加藥處理組稀釋為1 g·L－1，各取500μl（500μg總蛋白）裝于1.5 ml EP管，各加入Hsp90抗體2μg，在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上4℃垂直旋轉(zhuǎn)孵育過夜。每管加入20μl protein A Mag sepharose，4℃垂直旋轉(zhuǎn)孵育2 h。置于磁力架上，分層后棄去上清，NP-40裂解液重懸，繼續(xù)放回磁力架分層，用預冷的PBS清洗2次后，離心收集復合物，98℃蛋白變性5 min，免疫印跡法檢測Hsp90和CDC37。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計處理，結(jié)果以ˉx±s表示，實驗獨立重復3次，采用One-Way analysis of variance統(tǒng)計分析。

Fig 2 Proliferous inhibition of FW-04-806 against HER2-positive gastric cancer cell linesA：The expression of HER2 was tested in four gastric cancer cells by flow cytometry.NCI-N87 and OE19 cell lines overexpressed HER2 compared with AGSand SGC-7901 cell lines；B：Four gastric cancer cells were treated with FW-04-806 for 48h，HER2-positive gastric cancer cells showed more sensitivity to FW-04-806；C：NCI-N87 and OE19 were treated with increasing concentration of FW-04-806 for 10d.FW-04-806 inhibited both NCI-N87 and OE19 in colony formation；D：NCI-N87 and OE19 were treated with FW-04-806 for 24h.Degradation of HER2，Akt and inhibition of phosphorylated HER2，Akt，ERK were observed.

2 結(jié)果

2.1 FW-04-806有效抑制胃癌細胞增殖，對HER2陽性胃癌細胞更敏感 流式檢測結(jié)果表明（Fig 2A），NCI-N87、OE19、AGS與 SGC-7901胃癌細胞的HER2表達率分別為：（95.70±0.15）%、（92.18±0.29）%、（4.65±0.13）%、（3.54±0.19）%。不同濃度FW-04-806處理4株胃癌細胞48 h后，MTT結(jié)果表明（Fig 2B），隨著藥物濃度增加，F(xiàn)W-04-806明顯抑制NCI-N87、OE19、SGC-7901和AGS細胞的增殖，IC50分別為（24.17±0.16）、（29.61±0.27）、（60.59±0.26）、（58.13±0.18）μmol·L－1。FW-04-806對HER2陽性的胃癌細胞抑制作用強于HER2陰性細胞。

2.2 FW-04-806明顯抑制HER2陽性胃癌細胞集落形成 不同濃度FW-04-806處理NCI-N87、OE19細胞10 d后，結(jié)果表明（Fig 2C），F(xiàn)W-04-806能夠抑制NCI-N87和OE19細胞集落的形成，與對照組相比較，隨著藥物濃度的增加抑制作用愈趨明顯。

2.3 FW-04-806抑制胃癌細胞增殖信號通路的轉(zhuǎn)導 不同濃度FW-04-806作用NCI-N87、OE19細胞24 h后，免疫印跡結(jié)果表明（Fig 2D），F(xiàn)W-04-806減少 HER2和 Akt表達，阻斷 HER2、Akt、ERK的磷酸化。

2.4 FW-04-806使 HER2陽性胃癌細胞阻滯于G2-M期并誘導凋亡 不同濃度FW-04-806作用于NCI-N87和 OE19細胞48h，PI染色法、Annexin-VFITC／PI雙染法流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示（Fig 3A、3B），隨著藥物劑量增加，G2-M期比例和凋亡比例明顯增加。不同濃度FW-04-806作用于NCI-N87和OE19細胞24 h，免疫印跡法檢測結(jié)果可以看出（Fig 3C），隨著劑量增加，caspase-3、parp表達減少，cleaved caspase-3、cleaved parp凋亡蛋白表達增加。

Fig 3 FW-04-806 induces G2-M arrest and apoptosis in NCI-N87 and OE19 cellsA：NCI-N87 and OE19 were treated with FW-04-806 for 48h.Both cell lines showed an increase of G2-M arrest in a dose-dependent manner；B：Treatment with FW-04-806 for 48h induced dose-dependent apoptosis in NCI-N87 and OE19；C：24h treatment of FW-04-806 induced apoptosis in both NCI-N87 and OE19，followed by the increase of cleaved caspase-3 and cleaved parp.

Tab 1 Effect of FW-04-806 on the tumor growth of established OE19 xenografts（±s，n＝6）

Tab 1 Effect of FW-04-806 on the tumor growth of established OE19 xenografts（±s，n＝6）

Treatment with FW-04-806 200 mg·kg－1·d－1 for 3 wk caused tumor growth inhibition（TGI）of 48.0%.**P＜0.01 vs control group.

Group Dose／mg·kg－1 Body weight／g Start End Tumor weight／g TGI／%Control － 21.1±1.7 21.4±1.8 1.7±0.34 0 FW-04-806 50 21.1±1.0 20.9±0.6 1.6±0.15 6.1 200 21.3±1.2 21.0±1.8 0.9±0.23 48.0**

2.5 FW-04-806抑制OE19體內(nèi)腫瘤生長 不同劑量組FW-04-806每天灌胃給藥3周后，處死裸鼠，得到瘤塊（Fig 4A），瘤塊體積隨時間變化見Fig 4B，與對照組相比，200 mg·kg－1實驗組對OE19腫瘤的抑瘤率為48.0%（Tab 1）；免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，Akt、HER2蛋白表達明顯減少（Fig 4C）；將組織搗碎、提取裂解蛋白，免疫印跡法檢測顯示（Fig 4D），F(xiàn)W-04-806減少 Akt、HER2表達，抑制 Akt、HER2、ERK的磷酸化，阻斷細胞增殖信號通路，同時，增加cleaved parp的表達，誘導細胞凋亡。

2.6 FW-04-806誘導Hsp70表達，干擾CDC37與Hsp90的結(jié)合 不同濃度 FW-04-806分別作用NCI-N87和OE19細胞24 h，免疫印跡法檢測結(jié)果顯示（Fig 5A），F(xiàn)W-04-806對Hsp27的表達沒有明顯影響，但隨著濃度增加，Hsp70誘導表達明顯增加；40μmol·L－1FW-04-806作用OE19細胞24 h，免疫共沉淀法檢測結(jié)果表明（Fig 5B），F(xiàn)W-04-806解離Hsp90／CDC37復合物，減少 CDC37與 Hsp90的結(jié)合。

2.7 FW-04-806與拉帕替尼聯(lián)用具有協(xié)同作用不同濃度的FW-04-806聯(lián)合拉帕替尼作用NCI-N87細胞48 h，通過CompuSyn軟件聯(lián)合指數(shù)CI均小于1（Tab 2），表明FW-04-806與拉帕替尼聯(lián)合具有協(xié)同作用（協(xié)同作用：0＜CI＜1，拮抗作用：CI＞1）；Annexin-V-FITC／PI雙染法檢測結(jié)果顯示（Fig 6A），聯(lián)合用藥比單用誘導凋亡效果更好；兩藥聯(lián)合作用NCI-N87細胞24 h，免疫印跡法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)（Fig 6B），聯(lián)合用藥更有效抑制 HER2、Akt、ERK的磷酸化，并增加cleaved caspase-3、cleaved parp的表達。

Fig 4 FW-04-806 inhibits tumor growth in OE19 tumor xenograft modelsA：Tumor photos；B：While tumors achieved volume of approximately 100 to 200 mm3，OE19 tumor xenograft nude mice were randomized into groups（n＝6／group）treated with FW-04-806 at doses of 0，50，200 mg·kg－1·d－1，ig.Tumor volume was measured every 3 d；C：Representative immunohistochemistry of tumor tissues showed significant degradation of HER2 and Akt in OE19 tumors treated as indicated（10×）；D：Tumor tissues excised from the OE19 xenograft mice were lysed and tested the protein level changes in HER2，p-HER2，ERK，p-ERK，Akt，p-Akt，parp and cleaved parp.

Fig 5 FW-04-806 induces Hsp70 expression and inhibits the Hsp90／CDC37 interactionsA：NCI-N87 and OE19 cells were treated with FW-04-806 for 24 h，F(xiàn)W-04-806 induced the increase of Hsp70，while Hsp27 had no significant difference；B：OE19 cells were treated with 40μmol·L－1 FW-04-806 or DMSO for 24h.Hsp90 protein was immuoprecipitated from whole cell lysates with an anti-Hsp90 antibody and analyzed by immunoblot with antibodies against Hsp90 and CDC37.

Tab 2 Synergistic effect of FW-04-806 with lapatinib in NCI-N87 cells±s，n＝3）

Tab 2 Synergistic effect of FW-04-806 with lapatinib in NCI-N87 cells±s，n＝3）

NCI-N87 cells were treated with FW-04-806，lapatinib and combination of FW-04-806 and lapatinib for 48h，respectively.The combination of FW-04-806 and lapatinib showed greater inhibitory effect than single drug treatment（synergy：0＜CI＜1，antagonism CI＞1）.

D o s e L a p a／μ m o l·L－1 D o s e F W／μ m o l·L－1 C I 0.2 5 2 0.0 0.6 3 5±0.1 6 6 0.5 0 2 0.0 0.6 6 8±0.1 4 8 0.2 5 4 0.0 0.7 4 0±0.0 7 8 0.5 0 4 0.0 0.7 9 7±0.0 8 2

3 討論

HER2還沒有確定的配體，它可與別的HER家族成員發(fā)生同源或異源二聚化，引發(fā)自體磷酸化，激活下游的Ras-Raf-MAPK和PI3K-Akt-mTOR通路［9－10］。曲妥珠單抗（trastuzumab）為人源化單克隆抗體，選擇性地結(jié)合于HER2的細胞外部位，阻斷HER2的二聚化，是目前HER2陽性胃癌的一線治療藥物［11］。拉帕替尼是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，它可逆地結(jié)合于EGFR／HER-2酪氨酸激酶區(qū)的ATP結(jié)合位點［12］，抑制了受體激酶區(qū)的自身磷酸化，從而阻斷了下游信號通路。然而，針對HER2靶向的藥物臨床上都不可避免地出現(xiàn)了耐藥［13］。而HER2是Hsp90主要的客戶蛋白之一［14］，腫瘤中Hsp90的表達比正常細胞更活躍［15］，胃腺癌，尤其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌中，Hsp90的表達水平增加［16］，Hsp90調(diào)控的客戶蛋白包含眾多原癌基因蛋白，因此Hsp90抑制劑具有一靶多效的優(yōu)勢。

本實驗結(jié)果證明，F(xiàn)W-04-806作為鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物，對HER2陽性胃癌具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤活性。綜合FW-04-806對HER2陽性胃癌的研究結(jié)果，F(xiàn)W-04-806可能是一種新型的Hsp90抑制劑，其作用機制可能是通過減少CDC37／Hsp90復合物的形成，抑制Hsp90功能，從而降解Hsp90的客戶蛋白HER2、Akt，阻斷HER2下游Ras-Raf-MAPK和PI3K-Akt-mTOR信號通路，抑制腫瘤細胞增殖；另一方面，通過阻滯細胞周期于G2-M期，增加caspase-3、parp的切割，誘導細胞凋亡，從而達到抗腫瘤的效果。此外，F(xiàn)W-04-806聯(lián)合拉帕替尼對HER2陽性胃癌細胞NCI-N87生長抑制具有協(xié)同作用，該協(xié)同效果可能是通過聯(lián)合后加強對細胞增殖的抑制作用和對細胞凋亡的誘導作用這兩個途徑來實現(xiàn)。未來研究可以此為基礎(chǔ)，在體外培養(yǎng)對拉帕替尼的耐藥細胞株，進一步研究FW-04-806對HER2靶向藥物耐藥細胞株的抗腫瘤和克服耐藥的效果及機制，為開展該藥作為Hsp90抑制劑的研究提供理論依據(jù)。

綜上所述，F(xiàn)W-04-806抑制 HER2陽性細胞NCI-N87和OE19的增殖，誘導細胞凋亡，有效抑制OE19體內(nèi)異種移植瘤生長，對HER2陽性胃癌具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤活性，與拉帕替尼聯(lián)合對NCIN87細胞的生長抑制具有協(xié)同作用。

Fig 6 Synergistic effects of FW-04-806 with lapatinib in NCI-N87 in vitroA：Apoptotic induction in combination of FW-04-806 and lapatinib.Apoptosis rate increased when two drugs were combined for 48h；B：After 24h treatment with combination of FW-04-806 with lapatinib，cleaved caspase-3 and cleaved parp were enhanced，followed by blockage of HER2 downstream signaling pathways.

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