硫化氫抑制離體灌流大鼠急性心肌缺血所致心肌細胞凋亡研究

謝英花，馬燕山，張 楠，張建新

（1.河北科技大學藥學系，河北 石家莊 050018；2.石家莊市中醫院放射科，河北 石家莊 050051；3.河北省醫學科學院，河北石家莊 050021）

心肌缺血性損傷嚴重危害人類健康，是由冠狀動脈供血不足，心肌急劇的暫時的缺血和缺氧引起。若不及時處理，可誘發心絞痛及心肌梗死。研究表明，心肌細胞凋亡是心肌缺血、缺血／再灌注損傷、心力衰竭等的重要病理生理機制［1－3］。據報道，硫化氫（H2S）可調節心血管系統功能，抑制心肌細胞凋亡［2，4－5］。但是，其對離體灌流大鼠急性心肌缺血所致細胞凋亡的作用尚未見報道。為此，本研究觀察外源性H2S對離體灌流大鼠急性心肌缺血所致細胞凋亡的影響，為心肌缺血性損傷的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 NaHS、苯甲基磺酰氟（PMSF）、過硫酸 胺 （APS）、N，N，N，N-四 甲 基 乙 二 胺（TEMED）、甘氨酸、PVDF膜均購自美國 Sigma公司；兔caspase-3多克隆抗體、小鼠Cyt-C單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；RIPA組織／細胞裂解液、N，N-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自北京索萊寶科技有限公司；細胞核蛋白／漿蛋白抽提試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；預染蛋白Marker、BCA法蛋白定量試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；TUNEL試劑盒（In situ cell death detection kit-POD）購自美國Roche公司。

1.2 儀器 高速冷凍離心機1-15k（美國Sigma公司）；T-05X20-2A凝膠掃描分析系統（法國VL公司）；水平電泳儀、水浴電轉膜儀（北京市六一儀器廠）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；石蠟切片機、撈片機（德國Leica公司）

1.3 模型制備及動物分組 健康♂SD大鼠40只（SPF級），體質量250～290 g，由河北省實驗動物中心提供。大鼠腹腔注射10%水合氯醛350μg·g－1麻醉后，迅速開胸，取出心臟，置于盛有混合氣飽和預冷K-H液的平皿中，清洗殘留血液，經主動脈逆行插管，懸掛于Langendorff灌注裝置，混合氣飽和的K-H液恒壓灌注。平衡20 min后，結扎冠狀動脈左前降支，引起心肌急性缺血。

將動物隨機分為5組：假手術組（Sham組，冠狀動脈左前降支只穿線但不結扎，其余操作同Ischemia組）、缺血組（Ischemia組，冠狀動脈左前降支結扎4 h，正常灌流液灌流）、NaHS5、10、20μmol·L－1后處理劑量組（冠狀動脈左前降支結扎2 h時更換為5、10、20μmol·L－1NaHS的灌流液，其余操作同Ischemia組）。

1.4 心肌組織病理學分析 心臟灌流結束后，摘取心臟，沖凈，取左心室前壁組織，在質量濃度為100 g·L－1的多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水，浸蠟包埋，制成光鏡切片，蘇木精－伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察心肌組織病理性損傷改變。

1.5 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 上述心肌組織石蠟切片采用TUNEL法（脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法）檢測心肌細胞凋亡，嚴格按試劑盒說明書進行標記染色。光鏡可見凋亡細胞核染成棕褐色，高倍鏡下每張切片隨機取5個以上視野，計算凋亡百分率。

1.6 Western blot法半定量測定心肌組織中caspase-3、Cyt-C蛋白表達 分別處理心肌組織，提取得到心肌組織中總蛋白（測定Cyt-C）和漿蛋白（測定caspase-3）。將所得心肌組織總蛋白或漿蛋白樣品與上樣緩沖液熱變性，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，用 TBST洗滌，5%脫脂奶粉封閉，加稀釋的caspase-3、Cyt-C一抗，再加相應的二抗，ECL顯色，掃描條帶，轉換為數字圖像，Image J圖像分析軟件半定量分析蛋白條帶。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織病理學改變 光鏡下可見Sham組心肌肌原纖維完整，排列整齊，無水腫、變性壞死等改變，心肌組織結構正常；Ischemia組存在局灶性病變，明顯變性壞死，水腫及炎性浸潤，心肌纖維呈波浪樣改變，排列紊亂，部分斷裂；而NaHS 5、10、20μmol·L－1后處理劑量組呈劑量依賴性地減輕心肌組織損傷的病理學改變（Fig 1）。

2.2 各組大鼠心肌細胞凋亡率的變化 如Fig 2所示，Ischemia組心肌細胞凋亡數明顯增加，凋亡率（24.36±1.56）%明顯高于 Sham組（9.83±1.26）%（P＜0.01），NaHS 10、20μmol·L－1后處理劑量組細胞發生凋亡水平降低，凋亡率分別為（16.24±0.92）%、（13.29±0.78）%，明顯低于 Ischemia組（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠心肌組織caspase-3和Cyt-C的蛋白表達情況 如Fig 3所示，與Sham組比較，Ischemia組Cyt-C和caspase-3的蛋白表達增強（P＜0.01）。與 Ischemia組比較，NaHS 10、20μmol·L－1后處理劑量組caspase-3的蛋白表達減弱（P＜0.05或P＜0.01）；NaHS 5、10、20μmol·L－1后處理劑量組 Cyt-C的蛋白表達下降（P＜0.05或P＜0.01）。

Fig 1 Effects of H 2 S on the pathological changes of myocardial tissue in rats by optical microscope（HE×200）A：Sham；B：Ischemia；C：5μmol·L－1 NaHS；D：10μmol·L－1 NaHS；E：20μmol·L－1 NaHS

3 討論

H2S是繼NO和CO之后的又一種內源性氣體信號分子。內源性H2S是由半胱氨酸經胱硫醚-β-合酶（CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）及 3-巰基丙酮酸轉硫酶（3MST）催化而產生，其中，CSE主要表達于血管組織和心肌中［6］。越來越多的研究表明，內源性H2S或其供體如Na2S、NaHS可發揮廣泛的心血管保護效應［2］。其中，H2S對心肌凋亡具有廣泛的拮抗效應，可明顯抑制氯化鈷或糖尿病心肌損傷引起的心肌 caspase-3活化、心肌細胞凋亡率升高［7－8］。研究證實，H2S對缺氧／復氧（H／R）心肌細胞凋亡的保護作用與拮抗線粒體通透性轉換孔道開放有關［9］。此外，在糖尿病大鼠心肌缺血／再灌注損傷中，H2S可通過下調細胞凋亡基因fas、fas配體（FasL）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達，阻斷細胞表面死亡受體途徑，發揮其保護作用［10］。

Fig 2 Apoptotic rate of myocardial cell byTUNEL assay in rats（×200）A：Sham；B：Ischemia；C：5μmol·L－1 NaHS；D：10μmol·L－1 NaHS；E：20μmol·L－1NaHS.**P＜0.01 vs sham group；＃＃P＜0.01 vs ischemia group

細胞凋亡可能是心肌細胞損傷中的重要環節之一，抑制細胞凋亡便能明顯縮小心肌梗死的面積［3，11－12］。本文通過 TUNEL法檢測發現，缺血 4 h后，Ischemia組心肌細胞凋亡數明顯高于Sham組（P＜0.01），證實了缺血損傷可誘導心肌細胞凋亡發生。而 NaHS 10、20μmol·L－1后處理劑量組細胞凋亡率明顯低于 Ischemia組（P＜0.01），說明NaHS后處理具有抑制缺血損傷所致心肌細胞凋亡的作用，光鏡下心肌組織病理學改變也充分顯示了這一點。NaHS后處理可明顯逆轉缺血所致的心肌纖維、細胞膜、細胞核等的結構改變。由上可見，NaHS后處理對離體灌流大鼠急性心肌缺血損傷有保護作用，且和其抑制心肌細胞凋亡有關。

凋亡機制的研究是現代心臟病學的研究重點。多基因參與介導調控的細胞凋亡主要涉及死亡受體通路和線粒體凋亡通路兩條通路［13］。Caspase家族負責細胞凋亡的啟動和執行，通過相應caspase基因的逐層激活，引起細胞的凋亡。在此級聯反應中，caspase-3為關鍵性蛋白酶，caspase-3被上游信號激活后可作用于其底物，使級聯反應放大，引起細胞凋亡。在線粒體凋亡通路中，線粒體腫脹、膜流動性降低、線粒體膜通透性轉換孔開放，可促進細胞色素C（Cyt-C）等的釋放，激活上游caspase蛋白酶，啟動細胞凋亡［3，8，12－13］。本文通過 Western blot檢測發現，Ischemia組 Cyt-C和 caspase-3的蛋白表達均比Sham組增強（P＜0.01），而 NaHS后處理劑量組Cyt-C的蛋白表達比Ischemia組減弱（P＜0.05或P＜0.01），NaHS 10、20μmol·L－1后處理劑量組caspase-3的蛋白表達比Ischemia組減弱（P＜0.05或P＜0.01）。因此，NaHS后處理抑制心肌缺血損傷引起細胞凋亡的機制可能與下調Cyt-C、caspase-3的蛋白表達有關，但它對其他凋亡相關蛋白的作用及機制，尚需進一步的深入研究。

Fig 3 Effects of H 2 S on the expression of caspase-3 and Cyt-C in myocardial tissue in rats by Western blotA：Sham；B：Ischemia；C：5μmol·L－1 NaHS；D：10μmol·L－1 NaHS；E：20μmol·L－1 NaHS.**P＜0.01 vs sham group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs ischemia group

我們實驗室前期研究發現：離體急性缺血損傷心肌在給予NaHS后，離體心肌中CSE的活性和H2S的含量可不同程度上升，左心室血流動力學指標明顯改善，心肌梗死體積明顯縮小，可使急性心肌缺血損傷減輕［14］。結合上述研究結果可知，離體心肌缺血后，外源性補充H2S，隨著心肌組織中H2S含量的升高，心肌組織中凋亡細胞減少，心肌缺血損傷減輕。從而表明H2S含量的變化對細胞凋亡起到重要的調節作用，其機制可能與減輕心肌細胞凋亡，下調Cyt-C、caspase-3的蛋白表達有關。

參考文獻：

［1］ Hausenloy D J，Yellon D M.New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury：targeting the reperfusion injury salvage kinase（RISK）-pathway［J］.Cardiovasc Res，2004，61（3）：448－60.

［2］ 廖 鋒，鄭 揚，耿 彬.硫化氫－新的心臟保護因子［J］.生理科學進展，2012，43（2）：111－4.

［2］ Liao F，Zheng Y，Geng B.Hydrogen sulfide-a new cardioprotective factor［J］.Prog Physiol Sci，2012，43（2）：111－4.

［3］ 史婷婷，白建平，梁月琴，等.芹菜素對大鼠缺血／再灌注心肌細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27（5）：666－71.

［3］ Shi T T，Bai JP，Liang Y Q，et al.Effect of apigenin on the cardiomyocyte apoptosis in rats with ischemia and reperfusion and the expression of Bcl-2，Bax，Caspase-3［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（5）：666－71.

［4］ Lavu M，Bhushan S，Lefer D J.Hydrogen sulfide-mediated cardioprotection：mechanisms and therapeutic potential［J］.Clin Sci（Lond），2011，120（6）：219－29.

［5］ 金紅芳，杜軍保，唐朝樞.“廢氣不廢”：氣體信號分子硫化氫的研究進展［J］.生理學報，2010，62（6）：495－504.

［5］ Ji H F，Du JB，Tang C S.“Waste gas is not waste”：advance in the research of hydrogen sulfide［J］.Acta Physiol Sin，2010，62（6）：495－504.

［6］ Eto K，Ogasawara M，Umemura K，et al.Hydrogen sulfide is produced in response to neuronal excitation［J］.J Neurosci，2002，22（9）：3386－91.

［7］ 廖新學，楊春濤，楊戰利，等.硫化氫對抗化學性缺氧引起的心肌細胞損傷及其機制［J］.中國藥理學通報，2009，25（8）：1012－7.

［7］ Liao X X，Yang C T，Yang Z L，et al.Hydrogen sulfide protects H9C2 cells against chemical hypoxia-induced injury and the underlying mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（8）：1012－7.

［8］ 賈 強，楊 銳，馬善峰，等.硫化氫對糖尿病大鼠心肌損傷保護作用及其抗凋亡機制研究［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（2）：172－6.

［8］ Jia Q，Yang R，Ma SF，et al.Anti-apoptotic role of hydrogen sulfide on cardio-protection in diabetic rats［J］.Acta Univ Med Anhui，2014，49（2）：172－6.

［9］ Yao L L，Huang X W，Wang Y G，et al.Hydrogen sulfide protects cardiomyocytes from hypoxia／reoxygenation-induced apoptosis by preventing GSK-3beta-dependent opening of mPTP［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298（5）：1310－9.

［10］Gao Y，Yao X，Zhang Y，et al.The protective role of hydrogen sulfide in myocardial ischemia-reperfusion-induced injury in diabetic rats［J］.Int J Cardiol，2011，152（2）：177－83.

［11］Jiang C M，Han L P，Li H Z，et al.Calcium sensing receptors induce apoptosis in cultured neonatal rat ventricular cardiomyocytes during simulated ischemia／reperfusion［J］.Cell Biol Int，2008，32（7）：792－800.

［12］郭 佳，肖傳實，白 瑞，邊云飛.脂聯素對大鼠缺血／再灌注心肌細胞凋亡及相關蛋白表達的影響［J］.中國藥理學通報，2012，28（7）：930－3.

［12］Guo J，Xiao C S，Bai R，Bian Y F.Effects of adiponectin on the cardiomyocyte apoptosis in rats induced by ischemia and reperfusion and the expression of the related protein［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（7）：930－3.

［13］王 平，張建新，李蘭芳，等.硫化氫對脂多糖誘導的大鼠肺組織細胞凋亡的影響［J］.中國藥理學通報，2012，28（8）：1159－63.

［13］Wang P，Zhang J X，Li L F，et al.Effects of hydrogen sulfide on pulmonary apoptosis induced by lipopolysaccharide in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（8）：1159－63.

［14］謝英花，馬燕山，張 楠，張建新.硫化氫對離體大鼠急性缺血心肌心功能的影響［J］.中國藥理學通報，2014，30（7）：1000－6.

［14］Xie Y H，Ma Y S，Zhang N，Zhang JX.Effects of hydrogen sulfied on cardiac function induced by acute myocardial ischemia in isolated hearts of rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30（7）：1000－6.