慢性間歇性低壓低氧增強丹皮酚舒張大鼠動脈的作用

郭 贊，宋士軍，宋 爽，馬 坤，于 雷，宋彥麗，馬會杰，張 翼

（河北醫科大學1.生理學教研室、2.2008級臨床醫學專業，河北 石家莊 050017）

丹皮酚（paeonol，Pae），又稱牡丹酚，主要是從常用中藥徐長卿、牡丹和芍藥中提取的活性成分。現已發現，丹皮酚具有抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤和抗菌作用，對腦缺血損傷有保護作用［1］。關于丹皮酚對血管功能的影響報道甚少，曾有報道，丹皮酚能夠舒張大鼠離體胸主動脈環［2］，丹皮水煎液靜脈注射使麻醉犬的血壓下降［3］。

大量研究表明，慢性間歇性低壓低氧（chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH）可增強機體對缺血、缺氧耐受性，對心臟、神經、肝臟等器官組織發揮保護作用［4－5］。也有研究表明，CIHH對動物血壓具有調節作用，可明顯降低原發性高血壓病人及自發性高血壓大鼠的動脈血壓［6］。我們以往研究顯示，CIHH處理可非內皮依賴性地降低大鼠胸主動脈對ANGⅡ誘發的收縮反應［7］，此作用可能參與CIHH的降壓作用。此外，我們研究也發現，CIHH可增強心臟對Anandamide的反應性。但CIHH對丹皮酚舒血管作用的影響，尚未見報道。

本研究以大鼠離體胸主動脈為研究對象，探討CIHH對丹皮酚舒張血管作用的影響，并探討其作用機制，為丹皮酚在缺氧環境下的臨床應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藥品及儀器 丹皮酚購自Alfa Aesar公司；去甲腎上腺素（NE）、心得安（propranolol）、乙酰膽堿（acetylcholine）、格列苯脲（glibenclamide）、左旋硝基精氨酸甲酯 （NG-nitro-L-arginine methylester，LNAME）購自 Sigma公司；吲哚美辛（indomethacin，Indo）購自 Calbiochem公司。其余為市售藥品。Krebs液（mmol·L－1）：氯化鈉 118、氯化鉀 4.7、氯化鈣2.52、硫酸鎂·7H2O 1.2、碳酸氫鈉24.2、磷酸二氫鉀1.18、葡萄糖11.0，調至 pH（7.4±0.05）。無鈣Krebs液為不加氯化鈣，其余相同。

SQG-4四腔器官浴槽系統（成都儀器廠生產）；HSS-1型恒溫浴槽（成都儀器廠生產）；BL-420E＋生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司生產）。

1.2 實驗動物和間歇性低壓低氧處理 ♂成年Sprague-Dawlay（SD）大鼠46只，每只大鼠可取得6～8個動脈環，每組動物中的每個動脈環均來自不同的大鼠，清潔級，體質量250～300 g，由本校實驗動物中心提供，合格證號：1001002，許可證號：CXK（冀）2008-1-003。CIHH組動物置于低壓氧艙接受28 d模擬5 000米海拔高度的低壓低氧（PB＝53.87kPa，PO2＝11.2 kPa，11.1%O2）處理，每天6 h，自由食水。正常氧組動物除不接受慢性低壓低氧處理之外，其余與CIHH組動物相同。

1.3 大鼠離體胸主動脈環制備和收縮活動的記錄方法 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50μg·g－1）麻醉，迅速開胸，取胸主動脈，置于盛有Krebs液的培養皿內，分離血管周圍組織，剪成長約3 mm的動脈環。實驗前，用 NE 0.62μmol·L－1檢測離體胸主動脈環的活性，選擇經 NE 0.62μmol·L－1處理后收縮的離體胸主動脈環；穩定2 h后，換液3次，開始實驗。去內皮方法和檢測：用粗細合適的金屬絲從血管腔通過，以去除血管內皮細胞，選擇NE 0.62 μmol·L－1預收縮后對 ACh 1.0μmol·L－1誘發的舒張反應大于70%，認為血管內皮完整，不引起舒張反應的標本作為去內皮。

直徑約0.1 mm的不銹鋼絲小心穿入離體主動脈環，制成三角環狀，隨后置于盛有5 ml Krebs液的浴槽內，持續通入95%O2和5%CO2混合氣。靜息張力為1 g。離體主動脈環通過不銹鋼絲和細線與張力換能器連接，分別接入1、2、3和4通道。用BL-420E＋生物機能實驗系統記錄張力。

1.4 CIHH處理后，丹皮酚對大鼠離體胸主動脈環收縮活動的影響

1.4.1 CIHH處理后，丹皮酚對NE誘發的大鼠離體胸主動脈環收縮活動的影響 將CIHH和正常氧大鼠各分為3組，每組均為8例。NE組：加入NE 0.62μmol·L－1，10 min后，加入等容量 Krebs液；NE＋丹皮酚組：加入 NE 0.62μmol·L－1，10 min后，累積加入丹皮酚，使其終濃度分別為10、20、40、80、160、320 mg·L－1，加藥間隔為 5 min；去內皮 ＋NE＋丹皮酚組：將血管去內皮，其余同NE＋丹皮酚組。記錄張力的變化。

1.4.2 CIHH處理后，丹皮酚對KCl誘發的大鼠離體胸主動脈環收縮活動的影響 將CIHH和正常氧大鼠各分為3組，每組均為8例。KCl組：加入KCl 20 mmol·L－1，10 min后，加入等容量 Krebs液；KCl＋丹皮酚組：加入 KCl 20 mmol·L－1，10 min后，累積加入丹皮酚，使其終濃度分別為10、20、40、80、160、320 mg·L－1，加藥間隔為 5 min；去內皮 ＋KCl＋丹皮酚組：將血管去內皮，其余同KCl＋丹皮酚組。記錄張力的變化。

1.4.3 CIHH處理后，心得安、L-NAME、格列苯脲和吲哚美辛對丹皮酚舒張大鼠離體胸主動脈環作用的影響 將CIHH和正常氧大鼠各分為5組，每組均為8例，即：蒸餾水＋NE＋丹皮酚組、心得安＋NE＋丹皮酚組、L-NAME＋NE＋丹皮酚組、格列苯脲＋NE＋丹皮酚組和吲哚美辛＋NE＋丹皮酚組。各組分別加入蒸餾水、心得安 10μmol·L－1、LNAME 0.3 mmol·L－1、格列苯脲 5μmol·L－1和吲哚美辛10μmol·L－1，10 min后加入 NE 0.62μmol·L－1，作用 10 min后，加入丹皮酚 80 mg·L－1，記錄張力的變化。

1.4.4 CIHH處理后，丹皮酚對NE誘發的大鼠胸主動脈環兩種收縮反應的影響 將CIHH和正常氧大鼠各分為對照組和丹皮酚組，每組均為8例。將胸主動脈環在Krebs液中溫浴，待收縮張力穩定后20 min，換無鈣 Krebs液溫浴，20 min后加入 NE 0.62μmol·L－1可引起收縮反應，此時引起的收縮為NE在無鈣液中促使細胞內鈣釋放所致；待收縮張力達最大值并穩定時，加入氯化鈣2.49 mmol·L－1，以恢復正常Krebs液中的鈣濃度，出現進一步收縮反應，這是NE作用下促使細胞外鈣進入細胞內所致。用Krebs液沖洗3次后，再置入Krebs液中溫浴20 min，換無鈣Krebs液溫浴，丹皮酚組此時加入丹皮酚80 mg·L－1，對照組則加入等容量Krebs液；20 min后重復加入NE和氯化鈣，觀察兩種收縮反應張力。并分別計算第2次占第1次收縮張力的百分比。

1.5 統計學方法 所有數據均用ˉx±s表示，多組間數據比較采用單因素方差分析（ANOVA），進一步組間比較選用SNK多重比較檢驗或Dunnett-t檢驗，顯著性水準取α＝0.05。以給藥前NE或KCl引起的血管最大收縮張力為100%，計算給藥后5 min的收縮張力占最大收縮張力的百分數。半數抑制濃度（inhibitory concentration at 50%，IC50）的計算用Logit法。

Fig 1 Effects of paeonol on contractive activity induced by NE of isolated rat aorta rings after CIHH±s，n＝8）NE：Norepinephrine；Pae：Paeonol；Normal：Normal oxygen；CIHH：Chronic intermittent hypobaric hypoxia；WE：Whip off endothelium.*P＜0.05 vs CIHH＋NE group（B），by F test and SNK test；*P＜0.05 vs NE group（C），by F test and SNK test；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Normal＋NE＋Pae group（D），by t test.

2 結果

2.1 CIHH處理后，丹皮酚對NE誘發的大鼠離體胸主動脈環收縮活動的影響 CIHH組加入NE后，引起收縮的張力各時間點與正常氧組之間相比，經t檢驗差異均無顯著性（P＞0.05，Fig 1A），說明CIHH處理對NE引起的大鼠動脈環收縮反應無明顯影響。

在CIHH和正常氧大鼠，丹皮酚均使血管明顯舒張，IC50分別為51.56和 139.05 mg·L－1；經單因素方差分析和進一步SNK多重比較檢驗，NE＋丹皮酚組和去內皮＋NE＋丹皮酚組對NE誘發的主動脈收縮均有明顯對抗作用，CIHH和正常氧大鼠在丹皮酚劑量為20～320 mg·L－1時，與相應的NE組相比，差異有顯著性（P＜0.05，Fig 1B、C），但去內皮＋NE＋丹皮酚組與相應的NE＋丹皮酚組相比，差異均無顯著性，說明其作用均為非內皮依賴性的（P＞0.05，Fig1B、C）。

丹皮酚對CIHH大鼠的舒血管作用更為明顯，其NE＋丹皮酚組與正常氧大鼠比較，經t檢驗，當給藥濃度為20～320 mg·L－1時，兩組均值間差異有顯著性（P＜0.05，Fig 1D）。

2.2 CIHH處理后，丹皮酚對KCl誘發的大鼠離體胸主動脈環收縮活動的影響 CIHH組加入KCl后，引起收縮的張力各時間點與正常氧組之間相比，經t檢驗差異均無顯著性（P＞0.05，Fig 2A），說明CIHH處理對KCl引起的大鼠動脈環收縮反應無明顯影響。

在CIHH和正常氧大鼠，丹皮酚均使血管明顯舒張，IC50分別為72.44和 195.24 mg·L－1；經單因素方差分析和進一步SNK多重比較檢驗，CIHH和正常氧大鼠的KCl＋丹皮酚組和去內皮＋KCl＋丹皮酚組對KCl誘發的主動脈收縮均有明顯對抗作用，兩組在丹皮酚劑量為10～320 mg·L－1時與相應的KCl組相比，差異有顯著性（P＜0.05，Fig 2B、C），但去內皮＋KCl＋丹皮酚組與相應的KCl＋丹皮酚組相比，差異均無顯著性，說明其作用均為非內皮依賴性的（P＞0.05，Fig 2B、C）。

丹皮酚對CIHH大鼠的舒血管作用更為明顯，其KCl＋丹皮酚組與正常氧大鼠比較，經t檢驗，當給藥濃度為80～320 mg·L－1時，兩組均值間差異有顯著性（P＜0.05，Fig 2D）。

2.3 CIHH處理后，心得安、L-NAME、格列苯脲和吲哚美辛對丹皮酚舒張大鼠離體胸主動脈環作用的影響 經單因素方差分析和進一步Dunnett-t檢驗，在CIHH和正常氧大鼠，心得安和L-NAME均明顯對抗了丹皮酚的舒血管效應，心得安＋NE＋丹皮酚組和L-NAME＋NE＋丹皮酚組收縮張力與蒸餾水＋NE＋丹皮酚組之間相比，差異有顯著性（P＜0.05，Tab 1）；格列苯脲只對抗了CIHH大鼠丹皮酚的舒血管效應，在CIHH大鼠，格列苯脲＋NE＋丹皮酚組收縮張力與蒸餾水＋NE＋丹皮酚組之間相比差異有顯著性（P＜0.05，Tab 1）；在CIHH和正常氧大鼠，吲哚美辛＋NE＋丹皮酚組與蒸餾水＋NE＋丹皮酚組相比較，差異均無顯著性（P＞0.05，Tab 1）。

2.4 CIHH處理后，丹皮酚對NE誘發的大鼠胸主動脈環兩種收縮反應的影響 CIHH大鼠：丹皮酚組NE引起的細胞內鈣和細胞外鈣收縮張力明顯降低，與對照組相比差異均有顯著性（P＜0.01，Tab 2）。

正常氧大鼠：丹皮酚組NE引起的細胞外鈣收縮張力明顯降低，與對照組相比，差異有顯著性（P＜0.01，Tab 2）；丹皮酚組與對照組相比，NE引起的細胞內鈣收縮張力之間差異沒有顯著性（P＞0.05，Tab 2）。

Fig 2 Effects of paeonol on contractive activity induced by KCl of isolated rat aorta rings after CIHH±s，n＝8）Pae：Paeonol；Normal：Normal oxygen；CIHH：Chronic intermittent hypobaric hypoxia；WE：Whip off endothelium.*P＜0.05 vs CIHH＋KCl group（B），by F test and SNK test；*P＜0.05 vs KCl group（C），by F test and SNK test；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Normal＋KCl＋Pae group（D），by t test.

Tab 1 Effects of propranolol，L-NAME，glibenclamide and indomethacin on vasodilative effects of paeonol on isolated thoracic aorta rings after CIHH（xˉ±s，n＝8）

Tab 1 Effects of propranolol，L-NAME，glibenclamide and indomethacin on vasodilative effects of paeonol on isolated thoracic aorta rings after CIHH（xˉ±s，n＝8）

Paeonol：80 mg·L－1；NE：Norepinephrine；L-NAME：NG-nitro-L-arginine methylester；Normal：Normal oxygen；CIHH：Chronic intermittent hypobaric hypoxia.*P＜0.05 vs H2 O＋NE＋Paeonol group，by F test and Dunnett-t test.

Group CIHH Normal H2 O＋NE＋Paeonol 9.71 39.80±9.89 52.80±10.2 Propranolol＋NE＋Paeonol 79.78±13.39*75.65±11.26*L-NAME＋NE＋Paeonol 65.95±12.10*74.00±11.30*Glibenclamide＋NE＋Paeonol 59.19±12.66*58.06±9.78 Indomethacin＋NE＋Paeonol 45.49±9.86 56.44±

Tab 2 Effects of paeonol on NE-induced intracellular and extracellular calcium-dependent contraction in isolated thoracic aorta rings after CIHH（±s，n＝8）

Tab 2 Effects of paeonol on NE-induced intracellular and extracellular calcium-dependent contraction in isolated thoracic aorta rings after CIHH（±s，n＝8）

Paeonol：80 mg·L－1；CIHH：Chronic intermittent hypobaric hypoxia；Intra-Ca2＋contraction：NE-induced intracellular calcium-dependent contraction；Extra-Ca2＋contraction：NE-induced extracellular calcium-dependent contraction.**P＜0.01 vs control group，by t test.

CIHH Normal oxygen Control Paeonol Intra-Ca2＋contraction 100.66±20.43 69.71±14.51**Control Paeonol 99.73±21.02 91.97±15.54 Extra-Ca2＋contraction 99.84±20.24 52.24±11.04**98.55±20.91 64.28±12.80**

3 討論

CIHH作為增強機體、組織對缺氧耐受性的手段已被廣泛應用［8］。本研究表明，CIHH處理對大鼠離體動脈舒縮活動沒有明顯影響，其主要影響顯示在對藥物的反應上，CIHH明顯增強了丹皮酚的舒張血管效應，推測其機制可能是增強了與正常氧相同的作用途徑。除此以外，還通過激活ATP敏感性K＋通道和抑制內鈣釋放而發揮作用。

以往的研究表明，CIHH可以降低血壓［6］，推測CIHH可能造成心血管系統的功能和調節機制出現變化，包括對體液因素和藥物作用的反應發生改變。血管平滑肌細胞膜上的Ca2＋通道至少有兩種，電壓控制性 Ca2＋通道（voltage dependent Ca2＋channel，VDCC）和受體控制性 Ca2＋通道（receptor operated Ca2＋channel，ROCC）［9］。KCl使細胞膜去極化，主要打開VDCC，而加入NE主要打開ROCC［7］。本實驗中CIHH處理后，丹皮酚對KCl和NE誘發的大鼠離體胸主動脈環的收縮均有明顯的舒張作用，說明CIHH處理后，丹皮酚的舒血管作用既可以通過阻斷VDCC，也可以通過阻斷ROCC及相關途徑，其作用是直接作用，不依賴內皮。這在作用途徑上與正常氧動物是一致的，但是，CIHH明顯增強了丹皮酚舒張大鼠離體血管的作用，可能是因為CIHH使丹皮酚對VDCC和ROCC的阻斷程度更強。

β受體激動可使血管平滑肌舒張，心得安可以阻斷β受體［10］。本實驗中CIHH處理后，心得安部分阻斷了丹皮酚對大鼠血管平滑肌的舒張作用，推測丹皮酚的作用可能與激動β受體有關。L-NAME是NO合酶抑制劑，可以降低組織中NO的濃度。有研究表明，內皮細胞通過釋放NO，激活血管平滑肌細胞的鳥苷酸環化酶，引起環磷酸鳥苷（cGMP）升高，最終使血管舒張［11］。本實驗中 CIHH處理后，L-NAME部分阻斷了丹皮酚舒張大鼠血管平滑肌的作用，說明丹皮酚對血管的舒張作用可能與其使NO濃度增加有關。以上CIHH處理后，丹皮酚的激動β受體和使NO濃度增加的作用與正常氧動物在作用途徑上沒有區別，推測是作用程度上的不同。

平滑肌上存在ATP敏感型K＋通道，其激活可以使K＋外流增多，膜超極化平滑肌舒張［12］。格列苯脲是ATP敏感型K＋通道的阻斷劑，本實驗中CIHH處理后，格列苯脲部分阻斷了丹皮酚舒張大鼠血管的作用，而對正常氧大鼠無阻斷作用。推測與CIHH處理后，ATP敏感型K＋通道對丹皮酚的敏感性提高有關。

前列腺素族的前體花生四烯酸在環氧合酶等的作用下，可以形成前列環素（PGI2）等舒張血管的［13］物質，以及前列腺素H2和血栓烷A2等收縮血管的物質。丹皮酚舒張CIHH和正常氧大鼠血管的作用未被吲哚美辛阻斷，提示丹皮酚的作用與前列腺素類物質無關。

NE可以激動腎上腺素能受體，通過酪氨酸激酶信號途徑促進內鈣釋放和外鈣內流［14］，但在無鈣營養液中，NE可迅速誘發血管收縮的作用是促進細胞內鈣釋放所致。本實驗中CIHH處理后，丹皮酚明顯抑制了NE誘發的細胞內鈣和外鈣性收縮，而在正常氧動物，丹皮酚未抑制細胞內鈣性收縮。已有的研究表明，CIHH在某些病理狀態發揮保護作用，其機制可能與CIHH可改變某些通道的基因表達、蛋白的表達及通道的功能有關［15－18］。基于此，我們推測，CIHH處理后，可能改變了某些通道的數目或功能狀態，使丹皮酚對內鈣的釋放發揮了抑制作用，當然，這些尚待進一步深入研究。

本實驗提示，CIHH可以從受體、通道和離子釋放等方面影響藥物的作用，影響藥物原有的作用機制或通過新的作用途徑發揮作用，臨床治療時應該考慮缺氧對藥物作用的影響。

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