二氫楊梅素對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的改善作用及其機制研究

萬星驛，高麗輝，馮國華，張 媛，劉 旭，李 玲

（1.昆明醫科大學生物醫學工程研究中心，云南昆明 650500；2.湖南省兒童醫院，湖南長沙 410007）

胰島素抵抗是機體對胰島素的生物學效應降低的一種狀態，即在胰島素的刺激下細胞攝取利用葡萄糖的能力降低。脂肪組織作為胰島素作用的外周靶組織之一，在胰島素抵抗的發生發展中起著重要作用。脂肪細胞對葡萄糖的攝取依賴于細胞膜上分布的葡萄糖轉運體4（glucose transporter 4，GLUT4），在胰島素的刺激下能將細胞外的葡萄糖轉運至細胞內，而胰島素信號通路的轉導異常將導致胰島素抵抗。蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB／Akt）是胰島素信號通路的關鍵激酶，而脂聯素（adiponectin）則是脂肪細胞分泌的激素，它們均與胰島素抵抗相關。

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）化學結構為 3，5，7，3′，4′，5′-六羥基-2，3雙氫黃酮醇，是一種重要的黃酮類化合物，廣泛存在于楊梅科、葡萄科、杜鵑科、大戟科等植物中，具有抗氧化、抗菌消炎、抑制腫瘤、保護肝臟、抗高血壓、調節血糖血脂［1］等藥理作用。

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前期研究表明，DMY能明顯降低四氧嘧啶性糖尿病小鼠的血糖水平和改善糖耐量［2］。陳靜等［3］研究也發現，DMY能改善D-半乳糖誘導的大鼠糖耐量異常狀態，降低胰島素抵抗。體外實驗表明［4］，DMY能增加高糖高胰島素誘導的胰島素抵抗L6肌管細胞的葡萄糖攝取量，改善其胰島素抵抗狀態。然而DMY對脂肪細胞胰島素抵抗的影響和機制尚未見報道。因此，本研究擬采用地塞米松誘導3T3-L1脂肪細胞形成胰島素抵抗，探討DMY對脂肪細胞胰島素抵抗的改善作用，并以Akt、GLUT4、脂聯素為靶點初步探討作用機制，為DMY的進一步研究和開發提供實驗和理論依據。

O’Malley&Chamot(1990)將學習策略分為三類，一是是元認知策略、二是認知策略、三是社會/情感策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 3T3-L1前脂肪細胞購于ATCC（A-merican Type Culture Collection）。

2.3 DMY對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞GLUT4、Akt2和脂聯素基因表達的影響

1.1.2 試劑 DMY購自寧波德康生物制品有限公司，純度＞90% （HPLC）。H-DMEM和新生牛血清（NBCS）購自Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自 Hyclone公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 （IBMX）、地塞米松、胰島素均購自Sigma公司；羅格列酮購自北京高博醫藥化學技術開發有限公司；葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物技術有限公司；總RNA提取試劑盒購自天根公司；逆轉錄試劑盒和Taq DNA聚合酶均購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3 儀器 CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；百級層流超凈臺（珠海市再鑫儀器有限公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；全波長酶標儀（美國Molecular Devices公司）；PCR擴增儀（美國Bio-RAD公司）

結果顯示，胰島素刺激下，地塞米松模型組GLUT4的基因表達量較正常組明顯下降（P＜0.05）；加入1×10－8mol·L－1的 DMY和 1×10－6mol·L－1的羅格列酮作用后，胰島素抵抗脂肪細胞GLUT4基因的表達量較地塞米松組明顯增加（P＜0.01，Fig 3），提示DMY能促進脂肪細胞表達GLUT4基因。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與誘導分化 3T3-L1前脂肪細胞以1×107cells·L－1的密度接種于96孔板，用含10%NBCS的H-DMEM完全培養基培養，置于CO2培養箱內，待細胞生長融合至接觸抑制后2天，參照文獻［5］加入含 0.5 mmol·L－1IBMX、1μmol·L－1地塞米松、1 mg·L－1胰島素和 1μmol·L－1羅格列酮的H-DMEM培養基 （含10%FBS）培養2 d，再換為含1 mg·L－1胰島素的10%FBS H-DMEM培養基繼續培養2 d，之后更換為10%FBS H-DMEM完全培養基培養，每2天換液1次，直至細胞完全分化成脂。

1.2.2 DMY對正常3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取的影響 參照文獻方法［6］取分化成脂的細胞設正常組、DMY 1×10－5、1×10－6、1×10－7、1×10－8mol·L－1濃度組和羅格列酮1×10－6mol·L－1組，作用48 h，采用葡萄糖氧化酶法測定各組細胞培養液中的葡萄糖含量，并計算出葡萄糖的消耗量。每組3復孔，重復3次以上。

在1 nmol·L－1的胰島素刺激下，地塞米松模型組的葡萄糖消耗量較正常組減少18.4% （P＜0.01），表明其對胰島素的敏感性下降。DMY（1×10－6～1×10－8mol·L－1）濃度依賴性的增加胰島素抵抗脂肪細胞的葡萄糖消耗量（Fig 2），與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.05，0.01），與羅格列酮相比，差異無統計學意義，提示DMY能促進胰島素的作用，改善脂肪細胞的胰島素抵抗狀態。

1.2.4 DMY對GLUT4、Akt2和脂聯素基因表達影響 ①總RNA的提取和反轉錄反應：參照試劑盒說明書提取3T3-L1脂肪細胞的總RNA。定量后，依次 加入 Oligo（dT）18primer 1μl，RNase-Free ddH2O和RNA，置于 PCR擴增 儀中65℃反應5 min后取出，加入 5×Reaction Buffer 4μl，Ribolock RNase Inhibitor 1μl，10 mmol·L－1dNTP Mix 2μl，Revert Aid Reverse Transcriptase 1μl，充分混勻后，放入PCR擴增儀中，42℃反應60 min，70℃反應 5 min，反應產物于－20℃保存備用。② PCR反應：冰上操作，加入 Taq酶 10μl，引物 2μl，cDNA 2～4 μl，RNase-Free ddH2O加至20μl。充分混勻后放入PCR擴增儀。循環的條件為：94℃預變性5 min，94℃變性 30 s，57.4（GLUT4）／55.3℃（Akt2）／54.7℃（脂聯素）退火 35 s，72℃延伸 45 s，32個循環72℃繼續延伸10 min。擴增產物于4℃保存備用。③PCR擴增片段的凝膠電泳：先將擴增產物與6×loading buffer（含2.5%核酸染料）以5∶1混合均勻，取其中6μl加入質量分數為0.015的瓊脂糖凝膠。GLUT4和Akt2擴增片段于80 mV恒定電壓進行電泳60 min。脂聯素擴增片段于80 mV恒定電壓進行電泳65 min。電泳結果采用凝膠成像系統拍攝，通過 Quantity One軟件進行定量分析。GLUT4上游引物：5′-GCTTTGTGGCCTTCTTTGAG-3′；下游引物：5′-CGGCAAATAGAAGGAAGACG-3′；Akt2上游引物：5′-TCGGCAAGGTCATTCTGGT-3′；下游引物：5′-GGCATACTCCATCACAAAGCA-3′；脂聯素 上游引物：5′-GACGTTACTACAACTGAAGAGC-3′；下 游 引 物：5′-CATTCTTTTCCTGATACTGGTC-3′；內參為 GAPDH 上游引物：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′；下游引物：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

海上絲綢之路是古代中國與世界其他區域進行文化交流和經濟貿易的海上通道。海上的歷史最早可追溯到西漢時期，以徐聞、合浦等港口為起點。宋元時期，中國的造船技術和航海技術有極大的提升，促進了海上絲路貿易的發展。廣州是海上絲綢之路的重要港口，其獨特的地理位置，往來貿易日益繁華，在此背景下廣彩瓷器應運而生，成為“十八世紀歐洲的寵兒”。正因廣彩是絲綢之路的產物，貿易互通對廣彩的風格樣式造成了巨大的影響，造就了廣彩金碧輝煌的視覺效果和歡快明亮的洛可可裝飾風格，成就了獨特的廣彩藝術。

1.2.5 統計學分析 數據采用ˉx±s表示，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 DMY對正常3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響 實驗結果顯示，正常3T3-L1脂肪細胞加入系列濃度的 DMY（1×10－5～1×10－8mol·L－1）作用48 h后，其葡萄糖消耗量與正常組相比，差異無統計學意義（Tab 1）。

Tab 1 Effect of DMY on glucose consumption in 3T3-L1 adipocytes±s，n＝3）

Tab 1 Effect of DMY on glucose consumption in 3T3-L1 adipocytes±s，n＝3）

Group Concentration／mol·L－1 Glucose consumption／mmol·L－1 Control 5.06±0.11 DMY 1×10－5 4.94±0.36 1×10－6 4.95±0.13 1×10－7 4.87±0.18 1×10－8 5.07±0.11 Rosiglitazone 1×10－65.04±0.18

2.3.1 DMY對GLUT4基因表達的影響 RT-PCR

粘貼加固方法主要是在鋼板與混凝土表面之間加墊款，再采用環氧樹脂膠泥對周邊進行有效的封閉，使混凝土與鋼板形成封閉的空腔，同時對每片鋼板最低點實施注膠，這在較大程度上有利于注膠內空氣的排出。對鋼板采用粘貼加固方法時，首先對混凝土松散層進行清理至平整為止，在此基礎上對鋼板粘接面采用工具清理干凈，再用專業的工具在鋼板中涂抹結構膠，最后將鋼板粘貼到預定的位置，同時對其進行鉆孔固定。

Fig 1 Effect of DMY on basal glucose consumption in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes（±s，n＝3）△△P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs dexamethasone group.

1.2.3 3T3-L1細胞胰島素抵抗模型的建立與藥物處理 參照文獻方法［6－8］，取誘導分化的3T3-L1脂肪細胞分為正常對照組、地塞米松模型組、DMY系列濃度組（1×10－6～1×10－8mol·L－1）和陽性藥物羅格列酮1×10－6mol·L－1組。正常對照組用10%FBSH-DMEM完全培養基培養7 d，其余各組給予1×10－6mol·L－1地塞米松培養7 d誘導形成胰島素抵抗模型，地塞米松作用4 d后加入受試藥物DMY和羅格列酮，加入胰島素刺激或藥物單獨作用，72 h后采用葡萄糖氧化酶法測定各組細胞培養液中葡萄糖含量，并計算出葡萄糖的消耗量。每組3復孔，重復3次以上。此外，收集細胞提取RNA，凍存于 －80℃備測 GLUT4、Akt2和脂聯素基因。

Fig 2 Effect of DMY on insulin-stimulated glucose consumption in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes±s，n＝3）△△P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs dexamethasone group

取5份100 g的藕片，放入300 g水中，加入硬化劑的濃度為1.1%，分別在20，30，40，50，60 ℃的條件下硬化2 h，根據感官評價選擇合適的硬化溫度。

2.2 DMY對地塞米松誘導3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的改善作用 在無胰島素刺激的情況下，地塞米松模型組的葡萄糖消耗量較正常組明顯減少（P＜0.01），提示胰島素抵抗模型復制成功。而加入 5×10－7～1×10－8mol·L－1DMY和陽性藥物羅格列酮（1×10－6mol·L－1）作用72 h后，其葡萄糖消耗量較地塞米松模型組明顯增加（P＜0.01，Fig 1），提示DMY單獨作用能改善脂肪細胞基礎狀態下的胰島素抵抗狀態。

實驗使用的腦電數據集由德國波恩大學的癲癇研究實驗室收集。該腦電數據集來自五名志愿者，包含兩名健康人和三名癲癇病患者，對應的五個數據集分別標記為Z，O，N，F，S。其中，腦電數據的采集位置如表1[7]所示，每個數據集包含100個信道，腦電信號的采樣頻率、持續時間和采樣點數分別為173.61Hz、23.6s和4097個。

Fig 3 Effect of DMY on GLUT4 mRNA expression in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes（±s，n＝3）△P＜0.05 vs control group；**P＜0.01 vs dexamethasone group.

2.3.2 DMY對Akt2基因表達的影響 RT-PCR結果顯示，在胰島素刺激下，地塞米松模型組Akt2基因的表達量較正常對照組明顯下降（P＜0.05），加入 DMY 1×10－8mol·L－1和1×10－6mol·L－1羅格列酮后，胰島素抵抗脂肪細胞Akt2基因的表達量明顯增加，與地塞米松模型組比較，差異有統計學意義（Fig 4），提示DMY能上調胰島素抵抗脂肪細胞Akt2基因的表達。

2.3.3 DMY對脂聯素基因表達的影響 實驗結果表明，地塞米松作用后，在胰島素刺激條件下，脂聯素基因表達量較正常組明顯下降（P＜0.05）。1×10－7和1×10－8mol·L－1DMY組和 1×10－6mol·L－1羅格列酮組均能明顯上調脂聯素基因表達量（P＜0.05），其中 DMY 1×10－8mol·L－1組的脂聯素基因表達量與正常組相比P＜0.05，與Dex組比較P＜0.01（Fig 5），提示DMY能促進胰島素抵抗脂肪細胞脂聯素基因的表達。

除了試驗示范的多個優質稻新品種，觀摩現場還展示了多種智能化農機具——激光平地機作業精度達到正負兩厘米，一小時可以作業2～3畝；旋耕、施肥、播種一體機，可以控制播種深度，實現種肥精確控制，節本效果明顯；無人駕駛智能收割機，可以實現自主導航路徑規劃與作業，自動行駛、收割、脫粒、卸糧。

Fig 4 Effect of DMY on Akt2 mRNA expression in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes（±s，n＝3）△△P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs dexamethasone group.

Fig 5 Effect of DMY on adiponectin mRNA expression in insulin resistant 3T3-L1 adipocytesˉx±s，n＝3）△P＜0.05 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs dexamethasone group.

3 討論

胰島素抵抗是指肌肉、肝臟和脂肪細胞等靶器官對胰島素的生理作用反應性下降或敏感性降低，其中脂肪組織在胰島素抵抗的發生發展中起到關鍵作用，肥胖和脂肪性營養不良都可能引起胰島素抵抗。本實驗采用地塞米松誘導3T3-L1脂肪7 d后，在有或無胰島素刺激下，地塞米松組的細胞葡萄糖消耗量均較正常組明顯減少，提示胰島素抵抗模型復制成功。加入 DMY（5×10－7～1×10－8mol·L－1）后，無論有或無胰島素的刺激，DMY均能增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖消耗量，提示DMY可改善地塞米松誘導脂肪細胞形成的胰島素抵抗狀態。但DMY對正常3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖攝取無明顯影響。

葡萄糖是極性分子，需借助于葡萄糖轉運蛋白才能進入細胞內，其中GLUT4介導了脂肪細胞對葡萄糖的轉運［9］。基礎狀態下，GLUT4主要分布在細胞內的囊泡中，在胰島素刺激下，GLUT4大量易位至細胞膜，將細胞外的葡萄糖攝取進入細胞內。GLUT4表達數量的減少或易位受阻皆有可能引起胰島素抵抗。本研究發現地塞米松模型組的細胞GLUT4基因表達量較正常組明顯下調，與文獻報道一致［7，10－11］，加入 DMY后脂肪細胞的 GLUT4表達量明顯增加，提示DMY改善胰島素抵抗的作用可能與上調GLUT4基因的表達量有關。

Akt是胰島素信號轉導通路的關鍵激酶，在PI3K的作用下被激活，活化的 Akt能直接刺激GLUT4易位到細胞膜上，從而轉運葡萄糖［12］。抑制Akt的基因表達或者抑制其磷酸化均能明顯抑制胰島素依賴的 GLUT4易位，產生胰島素抵抗。Akt主要有3種亞型，其中Akt 2分布于脂肪組織，與糖代謝密切相關［13］，參與細胞內的胰島素信號轉導。本研究發現地塞米松使脂肪細胞Akt2的基因表達量明顯下降，而DMY則能促進脂肪細胞表達Akt2，提示DMY改善胰島素抵抗的機制與上調Akt2基因的表達有關。

脂聯素是脂肪組織分泌產生的一種細胞因子，脂聯素與其受體結合后，激活AMPK信號通路，進而發揮脂肪酸氧化、蛋白質分解、細胞保護作用和葡萄糖攝取等多種藥理作用［14］。研究表明，脂聯素和胰島素抵抗呈負相關，脂聯素基因敲除小鼠可出現胰島素抵抗，而補充脂聯素可以逆轉胰島素抵抗［15－17］。本研究表明地塞米松能下調脂聯素基因的表達，與文獻報道一致［18］。而加入DMY作用后能明顯上調胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的脂聯素基因表達量，提示促進脂聯素基因的表達可能是DMY改善胰島素抵抗的另一機制。

綜上所述，DMY在有或無胰島素刺激下均能增加地塞米松誘導的胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖消耗量，改善胰島素抵抗狀態，同時不影響正常脂肪細胞的糖攝取。DMY改善胰島素抵抗的機制可能與上調胰島素信號通路中的Akt2和GLUT4的基因表達，以及上調脂聯素基因的表達有關，但是DMY是否能促進Akt2的磷酸化和GLUT4的易位還有待進一步的研究。

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