動態濁度法測定醒腦靜注射液的細菌內毒素含量

湯秋華 林 輝 張一帆 黃祥昌

（福建醫科大學附屬泉州第一醫院，福建 泉州 362000）

動態濁度法測定醒腦靜注射液的細菌內毒素含量

湯秋華 林 輝 張一帆 黃祥昌

（福建醫科大學附屬泉州第一醫院，福建 泉州 362000）

目的建立醒腦靜注射液中細菌內毒素含量測定方法。方法采用《中國藥典》2010年版二部附錄中細菌內毒素的動態濁度法。結果將醒腦靜注射液稀釋80倍，用細菌內毒素定量法檢測無干擾因素影響，其平均回收率均在50%～200%。結論該法快捷、準確、靈敏，可用于醒腦靜注射液中細菌內毒素的檢測。

醒腦靜注射液；細菌內毒素；動態濁度法鱟試驗

醒腦靜注射液是由麝香、冰片、梔子、郁金四味中藥提取精制而成的中藥制劑，能夠透過血腦屏障，直接作用于中樞神經系統，能有效降低血腦屏障通透性，起到調節中樞神經，保護大腦、減輕腦水腫和改善微循環等作用，具有清熱瀉火，涼血解毒，開竅醒腦功效。臨床用于治療腦血管意外、乙型腦炎、肺性腦病、心絞痛等療效較好，且療效確切[1]。現國家標準中規定了熱原檢查項[2]，注射劑量為2 mL/kg。現有文獻僅有用凝膠法檢測醒腦靜注射液中細菌內毒素的研究報道[3]，但未見采用動態濁度法對其進行細菌內毒素的檢測，本文根據中國藥典2010版藥典中細菌內毒素檢查法研究的指導原則要求，探討了動態濁度法定量檢測醒腦靜注射液細菌內毒素的可行性，結果滿意。

1 材 料

BET-48G細菌內毒素測定儀（天津市天大天發科技有限公司）；ZH-2型自動旋渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；定量鱟試劑（TAL，批號120813，檢測限0.01～10 EU/mL，規格0.5毫升/支，廈門市鱟試劑實驗廠有限公司）；細菌內毒素檢查用水（BET，批號110801，規格10毫升/支，內毒素含量＜0.005 Eu/mL，廈門市鱟試劑實驗廠有限公司）；細菌內毒素工作標準品（批號150601-201175，規格150毫升/支，中國藥品生物制品檢定所）；醒腦靜注射液（河南天地藥業股份有限公司，批號：20130427、20130721、20130830，規格：10毫升/支）；所有玻璃器皿經250 ℃至少2 h除去外源性熱原。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值（L）的確定[4]：L=K/M，K為規定的給藥途徑，即人每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑為5.0 EU/（kg·h）；M為人用每千克體質量每小時的最大供試品劑量，醒腦靜注射液成人一次最大用量為20 mL，取人體平均體質量為60 kg計算，所以M為20/（60×1）=0.33 mL/（kg·h），計算得樣品的細菌內毒素限值L為15 EU/mL。

2.2 標準曲線制備及可靠性實驗[4]：取細菌內毒素工作標準品一支，加BET水1 mL溶解，旋渦混合器上混合15 min后，用BET水對其逐級稀釋，使其最終濃度分別為2.0、0.5、0.125、0.03125 Eu/mL，每一步稀釋都在旋渦混合器上混合30 s，每一濃度取0.1 mL分別加到預先加有0.1 mL鱟試劑反應管內，混合均勻，立即插入到已設置好實驗程序的BET-48G細菌內毒素測定儀進行自動檢測，每一濃度重復3管；另取0.1 mL BET水加到預先加有0.1 mL鱟試劑反應管內做陰性對照，平行做2管。以反應時間T的對數與內毒素濃度C的對數作線性回歸，得標準曲線為：LgT=3.15299+（-0.38122LgC），|r|=0.9937＞0.980，標準曲線最低內毒素濃度點λ=0.03125 Eu/mL，陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，故標準曲線成立。

2.3 預干擾試驗

2.3.1 最大有效稀釋倍數（MVD）的計算[4]：按公式MVD=L× C/λ，L為醒腦靜注射液內毒素限值15 Eu/mL，c=1.0 mL/mL，λ=0.03125 Eu/mL，計算得透析液MVD為480倍。

2.3.2 樣品溶液配制及預干擾試驗：將醒腦靜注射液用BET水稀釋為20、40、80倍，記為Ai；同時另取3管進行同樣倍數的稀釋，但在稀釋液中添加濃度為0.5 Eu/mL的細菌內毒素溶液，作為樣品添加內毒素陽性對照管，記為Bi。分別取上述各液0.1 mL加到預先加有0.1 mL鱟試劑反應管內，混合均勻，立即插入到已設置好實驗程序的BET-48G細菌內毒素測定儀進行自動檢測，每一濃度重復2管，計算回收率（%）=（Bi液內毒素值-Ai液內毒素值）/0.5×100%，結果見表1。

表1 預干擾試驗結果

由表1可見，樣品添加內毒素平均回收率均在50%-200%范圍內，符合《中國藥典》2010年版二部規定，表明醒腦靜注射液在稀釋倍數為80以內對試驗均無干擾。經分析比較，選擇無干擾且回收率接近100%的80倍稀釋進行測定。

2.4 干擾試驗的驗證：為確證醒腦靜注射液80倍稀釋的有效性，進行3個批號醒腦靜注射液正式干擾試驗。按“2.3”項下方法，對3個批號醒腦靜注射液稀釋80倍進行干擾試驗，每個濃度重復2管，計算回收率，結果見表2。

表2 于擾試驗的驗證結果

由表2可見，將樣品稀釋80倍，樣品回收率均在有效范圍50%～200%范圍內，符合《中國藥典》2010年版細菌內毒素檢查法的有關規定，表明在該稀釋倍數下樣品對實驗無干擾，在這一濃度下測得的內毒素數值真實、有效，檢測醒腦靜注射液時選用稀釋倍數為80倍稀釋液即可。

3 討 論

3.1 本文通過建立定量檢測醒腦靜注射液中細菌內毒素的試驗方法，對完善該品種質量標準提供參考。經過方法學試驗考察，動態濁度法測定其內毒素含量的方法快速、準確、可靠。

3.2 試驗結果表明，用動態濁度法檢測醒腦靜注射液中細菌內毒素含量，當稀釋80倍時，其回收率可達到50%～200%，表明在該濃度下樣品對試驗結果無干擾，可用于醒腦靜注射液內毒素的定量檢測。

3.3 動態濁度法檢測范圍寬，靈敏度高，可對樣品中細菌內毒素進行定量檢測，反應樣品受內毒素污染的程度有著不同于凝膠法檢測的優勢，克服了凝膠法主觀人為判斷等因素的影響，且通過與凝膠法驗證對比，結果一致。

[1] 宋燕熙,焦億.醒腦靜注射液臨床應用概述[J].中國中醫藥科技,2010,17(5):472.

[2] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準[S].中藥成方制劑第十七冊.WS3-B-3353-98.

[3] 王梅娟,謝斌.醒腦靜注射液細菌內毒素檢測方法的建立[J].中國醫藥導報,2008,5(34):12.

[4] 中國藥典.二部[S].北京:中國醫藥科技出版社, 2010:附錄99-102.

Determination of Bacterial Endotoxin in Xingnaojing Injection by Kinetic Turbidimetry

TANG Qiu-hua, LIN Hui, ZHANG Yi-fan, HUANG Xiang-chang
(Affiliated Quanzhou First Hospital, Fujian Medical College, QuanZhou 362000, China)

ObjectiveTo establish a method to determine the content of bacterial endotoxin in Xingnaojing injection.MethodsKinetic turbidimetric limulus test of bacterial endotoxin were used according to Chp 2010.Results1→100 solution of Xingnaojing injection showed no interference on test and the average recovery was in the range of 50%～200%.ConclusionThis method is rapid, accurate and sensitive.It can be used for bacterial endotoxin test for Xingnaojing injection.

Injection of Xingnaojing; Bacterial endotoxin; Kinetic turbidimetric limulus test

R927.12

B

1671-8194（2014）22-0021-02