松果菊苷對血管性癡呆大鼠氧化應激損傷的保護作用

馬婧怡，張萬鑫，陳 虹，姜 勇，屠鵬飛，丁 慧

（1.石河子大學藥學院教育部新疆特種植物藥資源重點實驗室，新疆石河子 832002；2.北京大學中醫藥現代研究中心，北京 100083）

松果菊苷（echinacoside，ECH）是從新疆特色植物管花肉蓯蓉中分離、純化的一種苯乙醇苷類化合物。研究顯示，松果菊苷醇提取物可刺激巨噬細胞產生大量免疫增效因子，如腫瘤壞死因子、白介素Ⅰ、白介素Ⅱ等。另外，松果菊苷對神經細胞、內皮細胞的缺氧性損傷亦有明顯保護作用［1］，能夠改善學習記憶能力［2］、抗衰老［3］。血管性癡呆（vascular dementia，VD）是繼阿爾采末病（Alzheimer′s disease，AD）之后導致癡呆的第二位常見原因，它是指腦血管病變引起腦損害后所導致的癡呆，以記憶、認知功能缺損為主，同時還伴有語言、運動、視空間障礙以及人格障礙［4］。隨著VD發病率日益增高，給病人自身以及家屬乃至社會都帶來了沉重的負擔。由于其病因的復雜性，至今尚無特效藥物及治療手段。本實驗通過觀察ECH對大鼠大腦皮層及海馬組織勻漿中GSH、NO含量，GSH-Px、NOS活力以及海馬組織CA1區組織結構的影響，旨在探討其對抗VD，改善VD大鼠學習記憶能力的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 ECH由北京大學藥學院屠鵬飛教授提供（純度95%以上），氫溴酸加蘭他敏標準品（中國食品藥品檢定研究院，100050－200802），GSH、GSH-Px、NO、NOS試劑盒（南京建成生物工程研究所），水合氯醛（天津市福晨化學試劑廠），多聚甲醛（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器 十萬分之一天平（日本A＆G有限公司，HM-202型），Millipore超純水系統，精密電熱恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫療儀器廠，HHS型），高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠），Varioskan Flash 4.00.51酶標儀（美國Thermo electron公司），恒溫冰凍切片機（德國Leica公司，CM3050型），倒置顯微鏡（德國ZEISS公司，MIC0266型）。

1.3 實驗動物模型制備、分組及給藥 ♂ SD大鼠，清潔級，體質量250～350 g，購自新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心，許可證編號SCXK（新）2011－0002。經Morris水迷宮篩選學習記憶能力正常的大鼠95只，其中隨機選取80只采用間隔3d分2次永久性結扎大鼠雙側頸總動脈法（2-VO）制備VD模型大鼠［5］；剩余15只剝離但不結扎雙側頸總動脈，作為假手術大鼠，其余步驟同模型大鼠操作。術后6周，進行水迷宮實驗，篩選出50只成功的中度癡呆模型大鼠，即VD模型大鼠中各個大鼠各時段逃避潛伏期平均值與對照組大鼠逃避潛伏期平均值之差占該鼠的平均逃避潛伏期的比例在30%－40%之間的為中度癡呆大鼠［6］，隨機分為5組，每組10只：模型組、ECH低劑量組、ECH中劑量組、ECH高劑量組、陽性藥加蘭他敏組（Gal）；再從15只假手術大鼠中篩選出10只作為假手術組。分組完成后，各組大鼠每天腹腔注射相應的藥物或生理鹽水，連續4周。① 模型組（Model）：生理鹽水1 ml·kg－1·d－1；②ECH低劑量組（Low dose）：ECH 10 mg·kg－1·d－1；③ECH中劑量組（Middle dose）：ECH 20 mg·kg－1·d－1；④ECH高劑量組（High dose）：ECH 40 mg·kg－1·d－1；⑤陽性藥加蘭他敏組（Gal）：3 mg·kg－1·d－1；⑥假手術組（Sham）：生理鹽水 1 ml·kg－1·d－1。

1．4 皮層與海馬組織中GSH、NO含量及GSHPx、NOS活力的測定 各組隨機選取8只大鼠，將大鼠斷頭取腦，去掉嗅球和小腦，在冰浴中迅速剝離出皮層及海馬，用4℃預冷的生理鹽水洗凈組織表面的血液，吸干水分后分別稱重，再加入4℃預冷的生理鹽水經電動勻漿機于冰浴中分別制成質量分數為10%的皮層勻漿及海馬勻漿。將制備好的質量分數為10%的組織勻漿于離心機2 500 r·min－1離心10 min，取上清液，采用生化方法，嚴格按照試劑盒說明書的要求測定GSH、NO含量及GSH-Px、NOS活力。蛋白定量采用考馬斯亮藍定量。

1．5 HE染色觀察大鼠海馬組織CA1區組織結構的變化 各組剩余的2只大鼠，腹腔注射質量分數為10%水合氯醛（3.5 ml·kg－1）麻醉后仰臥固定，左心室灌注生理鹽水，剪破右心耳，直到右心耳流出清亮無色液體為止，后灌注質量分數為4%的多聚甲醛約500 ml。固定完畢后，迅速斷頭取腦，去掉嗅腦、小腦及低位腦干，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分，將腦組織置于質量分數為4%多聚甲醛中浸置4－6h（4℃）。將多聚甲醛浸置后的腦組織常規脫水、透明、浸蠟、包埋、連續冠狀切片，每張切片厚約5μm，進行HE染色，具體過程如下：①二甲苯Ⅰ、Ⅱ分別浸泡3次，各5 min。②分別用體積分數為1，0.95，0.90，0.80的乙醇洗滌1～2 min，用自來水充分漂洗。③蘇木精浸染5 min，取出，用自來水充分漂洗。④體積分數為0.01的鹽酸乙醇分化15 s，自來水漂洗。⑤伊紅染色3 min，自來水洗。⑥體積分數為0.80，0.90，0.95的乙醇沖洗1 min，體積分數為1的乙醇分別各浸泡3～5 min。⑦二甲苯Ⅰ、Ⅱ中分別各浸5 min，取出。⑧滴中性樹膠，封片。⑨在倒置熒光相差顯微鏡下觀察切片并拍照。1.6 統計學分析 運用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量數據用ˉx±s表示。生化指標采用單因素方差分析后進行多組間兩兩比較。

2 結果

2．1 ECH對VD大鼠皮層與海馬組織中 GSH、NO含量及GSH-Px、NOS活力的影響

2.1.1 ECH對各組大鼠皮層和海馬中GSH含量及GSH-Px活性的影響 Tab 1結果顯示：與假手術組相比，模型組、ECH低、中劑量及陽性藥加蘭他敏組大鼠的皮層和海馬組織中的GSH含量明顯降低（P＜0.01），GSH-Px活性明顯降低（P＜0．05，P＜0.01）；與模型組相比，ECH中、高劑量組以及陽性藥加蘭他敏組大鼠的皮層和海馬組織中的GSH含量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），GSH-Px活性明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與陽性藥加蘭他敏組比較，模型組及假手術組的GSH含量與GSH-Px活性均有明顯變化（P＜0．05，P＜0.01）。

2.1.2 ECH對各組大鼠皮層和海馬中NO含量及NOS活性的影響 Tab 2結果顯示：NO的含量變化，僅模型組與假手術組間差異有顯著性（P＜0.05）。ECH對各組大鼠NOS活力的影響結果如下：與假手術組相比，模型組、ECH低、中劑量組大鼠的皮層和海馬組織中的NOS活性明顯升高（P＜0．05，P＜0.01），除此以外，陽性藥加蘭他敏組海馬組織中的NOS活性也明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，ECH高劑量及假手術組大鼠的皮層和海馬組織中的NOS活性明顯降低（P＜0．05，P＜0.01），除此以外，ECH中劑量及陽性藥加蘭他敏組海馬組織中的NOS活性也明顯降低（P＜0.01）；與陽性藥加蘭他敏組比較，僅模型組、假手術組海馬組織中的NOS活性變化差異有顯著性（P＜0．05，P＜0.01）。

Tab 1 Effect of ECH on content of GSH and activity of GSH-Px in cerebral cortex and hippocam pus

Tab 1 Effect of ECH on content of GSH and activity of GSH-Px in cerebral cortex and hippocam pus

*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs model；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs Gal.

Group Dose／mg·kg－1·d－1 Content of GSH／μmol·g－1Pro Activity of GSH-Px（activity unit ）Cerebral cortex Hippocampus Model － 3.16±0.47**＃＃ 2.24±0.41**＃＃ 42.20±6.70**＃＃ 28.40±5.51**＃＃Cerebral cortex Hippocampus Low dose ECH 10 5.07±1.02** 4.16±0.65** 64.20±6.18**＃ 49.40±8.57**Middle dose ECH 20 6.19±0.74**Δ 5.30±0.79**Δ 78.80±7.99**ΔΔ 64.50±7.68**Δ High dose ECH 40 8.47±0.99ΔΔ 7.65±1.17ΔΔ 100.80±9.06ΔΔ 86.10±11.38ΔΔ Gal 3 6.94±0.58**ΔΔ 6.10±0.72**ΔΔ 88.30±7.10*ΔΔ 74.60±11.30*ΔΔ Sham － 10.35±1.02ΔΔ＃＃ 9.55±1.01ΔΔ＃＃ 118.90±11.71ΔΔ＃ 105.40±11.68ΔΔ＃

Tab 2 Effect of ECH on content of NO and activity of NOS in cerebral cortex and hippocampus

Tab 2 Effect of ECH on content of NO and activity of NOS in cerebral cortex and hippocampus

*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs model；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs Gal.

Group Dose／mg·kg－1·d－1 Content of NO／μmol·g－1Pro Activity of NOS／kU·g－1Pro Cerebral cortex Hippocampus Model － 4.70±0.91* 4.97±0.92* 1.16±0.27** 1.21±0.18**＃＃Cerebral cortex Hippocampus Low dose ECH 10 4.05±0.64 4.26±0.73 0.85±0.24* 0.91±0.08**Middle dose ECH 20 3.63±0.56 3.82±0.51 0.73±0.16* 0.77±0.09**ΔΔ High dose ECH 40 2.94±0.56 3.18±0.58 0.52±0.10Δ 0.61±0.11ΔΔ Gal 3 3.35±0.49 3.61±0.57 0.68±0.12 0.73±0.11*ΔΔ Sham － 2.41±0.56Δ 2.56±0.52Δ 0.23±0.05ΔΔ 0.32±0.07ΔΔ＃

2．2 ECH對VD大鼠海馬組織CA1區組織結構的影響 HE染色后，假手術組（Fig 1F）大鼠的海馬CA1區細胞數目多，排列整齊緊密，細胞形態完整，結構正常，胞質豐富，胞核與胞質界限清晰可見，核仁明顯。模型組（Fig 1A）大鼠的海馬CA1區細胞數目減少，細胞排列紊亂稀疏，細胞形態不完整，結構不正常，胞質稀少，胞核與胞質界限模糊，細胞核深染、固縮，呈三角形或不規則形，核仁不明顯，并出現增生膠質細胞。相比之下，各給藥組大鼠海馬CA1區神經元排列較整齊，結構相對正常，核固縮現象減少，深染程度降低，且ECH高劑量組變化更為明顯，接近于假手術組，ECH中劑量組及陽性藥加蘭他敏組次之，ECH低劑量組更為接近模型組，仍有嚴重的細胞核深染及固縮現象存在。

3 討論

氧化應激損傷表現在機體遭受到各種有害刺激時，由于體內高活性分子如活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）產生過多，氧化程度遠遠超出了機體氧化物的清除能力，體內氧化系統和抗氧化系統失衡，導致了組織損傷。氧化應激損傷被認為是機體衰老的根本原因，同時，在多種退行性疾病，包括神經元缺血性損傷中起著關鍵作用［7］。GSH能夠以非酶促反應的形式直接與氧自由基結合，達到清除自由基、抗氧化、抗衰老的目的，同時也可作為GSH-Px的底物，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞膜的結構和功能不受過氧化物的干擾及損害。NO作為一種自由基氣體，參與腦內許多生理過程，如腦血流調節學習記憶形成等［8］。研究表明，腦缺血時間增加，可使誘導型NOS（iNOS）激活，產生大量具有神經毒性的NO。而NO在VD的形成中發揮了重要作用，腦缺血時產生大量的NO與氧自由基反應生成過氧亞硝基陰離子，進而分解成毒性極強的氧化劑，導致腦組織的損傷加重［9］。大腦海馬CA1區是參與信息貯存和記憶的重要部分，也是腦缺血的最敏感區域之一，有研究顯示：海馬CA1區神經元的遲發性死亡可能是缺血性腦血管病導致癡呆的主要病因［10］。

Fig 1 Effect of ECH on tissue structure changes in rat hippocam pus CA1 area by HE staining（×400）A：Model group；B：Low dose group；C：Middle dose group；D：High dose group；E：Gal group；F：Sham group

本實驗研究結果顯示：給藥4周后，與假手術組比較，模型組大鼠皮層及海馬組織中的GSH含量以及GSH-Px活力有不同程度的降低，NO含量及NOS活力有不同程度的升高。與模型組相比，各給藥組大鼠皮層及海馬組織中的GSH含量以及GSH-Px活力有不同程度的升高，NOS活力有不同程度的降低，這表明皮層及海馬的氧化應激損傷參與了VD疾病的形成過程，ECH能夠清除自由基，降低氧化應激引起的損傷。而各給藥組的NO含量雖然降低，但與模型組比較差異并無顯著性，推斷可能是由于ECH對NOS的抑制量還不足以造成NO的減少量與模型組形成差異，或者是實驗過程中的操作誤差造成，為了進一步探討，可以重新實驗或者進行更進一步的同工酶測定，進一步準確說明ECH是否具有減少活性氮自由基NO的能力。由染色后各組大鼠海馬CA1區組織結構的變化可知，ECH可以改善慢性低灌注對CA1區神經元的損傷狀況。以上各試劑盒的測定以及組織結構的變化表明，ECH高劑量組與模型組差異最為明顯，且接近于假手術組，甚至優于陽性藥組，而ECH低劑量組接近于模型組。這表明ECH對VD大鼠的氧化應激損傷、海馬神經元損傷確實有改善作用，且與ECH的給藥量成線性相關，需要進一步探討更為準確的量效關系。

綜上所述，ECH對VD大鼠氧化應激損傷有較好的的保護作用。其抑制氧化應激損傷的作用是改善海馬神經元損傷、防治VD認知功能障礙的可能機制之一。該結果為進一步研究ECH對VD大鼠的治療作用及其機制奠定了基礎，是否有其它作用機制還有待于進一步深入探討。

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