白芍總苷對糖尿病大鼠腎組織中內質網應激的影響

武曉旭，章超群，許 坤，徐興欣，吳永貴

近年來研究［1－2］表明炎癥機制是糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發生、發展的主要機制之一，而內質網應激 (endoplasmic reticulum stress，ERS)反應可以引起一系列壓力信號的傳導，其中包括氧化應激和炎癥反應。在體外培養的實驗［3］中，有學者用不同濃度的晚期終末產物刺激鼠足細胞，發現葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)的表達增加，同時誘導ERS。在用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立大鼠1型糖尿病模型的動物實驗［4］中，顯示模型組腎組織GRP78和CHOP/GADD153表達升高，表明ERS和DN相互聯系。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從中國傳統中藥芍藥的干燥根中提取的混合物，具有抗炎和抑制自身免疫反應的作用［5］。TGP在臨床上已用于類風濕性關節炎患者改善病情;在大量人及動物實驗［6－9］中，也表明其對系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、變應性接觸性皮炎及佐劑性關節炎具有治療作用，且無明顯毒副作用。有研究［10］表明TGP對DN有明顯的保護作用，在此基礎上，該實驗從ERS通路觀察TGP對DN大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50只Munich-Wistar大鼠(購自安徽醫科大學實驗動物中心)，昆明種，普通級，180～200 g。

1.1.2 主要試劑 STZ(美國Sigma公司);尿白蛋白測定試劑盒(法國SPI公司);兔抗大鼠GRP78多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);兔抗大鼠磷酸化的蛋白激酶樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase，p-PERK)多克隆抗體及兔抗大鼠磷酸化的真核細胞翻譯起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，p-eIF2α)多克隆抗體(美國 Cell Signaling 公司);山羊血清、3%H2O2去離子水、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、二步法免疫組化檢測試劑盒PV-9000(北京中杉金橋生物技術公司)。

1.1.3 干預藥物 TGP由安徽醫科大學魏偉教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 飼養條件 實驗前所有大鼠均在室溫(22±2)℃、相對濕度(55±5)%、光照周期12～12 h的環境中適應飼養1周。實驗期間保證所有大鼠飲水、標準飲食充足，定時更換敷料，不予胰島素治療，連續觀察8周。

1.2.2 糖尿病大鼠分組和模型制備 大鼠適應飼養1周后，被隨機分為對照組(n=10)、模型組(n=10)和 TGP給藥組(n=30)。STZ使用前用0.01 mmol/L的無菌檸檬酸緩沖液配制為6.5 g/L，pH 4.5，模型組和TGP給藥組大鼠腹腔單次注射STZ(65 mg/kg)，對照組注射等量檸檬酸緩沖液。2～3 d后用血糖儀經尾靜脈采血測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L者視為糖尿病大鼠，TGP給藥組再隨機分為3組(n=10)，TGP使用前溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液中，每天按50、100、200 mg/kg灌胃給藥，對照組和模型組給予等量蒸餾水。

1.2.3 標本收集 實驗8周末，用代謝籠收集所有大鼠24 h尿液，記尿量，置于－80℃冰箱保存待測尿白蛋白。稱量大鼠體重，腹腔注射戊巴比妥麻醉大鼠，行右頸總動脈插管取血，置于－20℃冰箱中待測血糖。再通過右頸總動脈插管注入生理鹽水反復灌洗腎臟，去除包膜后稱量腎重。

1.2.4 生化指標的檢測 尿白蛋白含量使用酶聯免疫法測定，尿白蛋白含量與24 h尿量乘積即為UAER。血糖使用葡萄糖氧化酶法，用全自動生化分析儀測定。

1.2.5 免疫組化測定 GRP78、p-PERK 及 p-eIF2α的表達 腎組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成2 μm厚經多聚賴氨酸處理的切片，采用PV兩步法，石蠟切片烤片后常規脫蠟至水，微波熱修復抗原，3%H2O2去離子水室溫孵育以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗，甩干后滴加山羊血清37℃孵育封閉非特異性抗原，甩去山羊血清，分別滴加GRP78一抗(1∶1 000)，p-PERK一抗(1∶100)及p-eIF2α一抗(1∶100)，用PBS代替一抗作為陰性對照，4℃過夜，PBS沖洗，依次滴加聚合物輔助劑和辣根酶標記山羊抗兔/小鼠IgG多聚體37℃孵育，應用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片，鏡下觀察，陽性細胞呈棕黃色。

1.2.6 半定量分析 高倍鏡視野(×400倍)下每張切片隨機采集5個腎皮質區，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理圖像，用平均光密度(mean optical density，MOD)值判定結果。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，UAER為非正態分布資料，采用對數轉換后以幾何均數×/÷耐受因子表示。采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組一般情況及生化指標的變化 實驗期間，模型組及TGP給藥組大鼠均出現體重減輕，多飲、多尿、多食。實驗8周末，TGP不能阻止大鼠血糖增高和體重減低。與對照組相比，模型組大鼠相對腎重(腎重/體重)明顯增加 (P＜0.05)，血糖、UAER顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比，各TGP給藥組大鼠相對腎重有所下降，但差異無統計學意義;各TGP給藥組大鼠 UAER明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，見表1。

表1 各組大鼠一般指標變化(n=10，±s)

表1 各組大鼠一般指標變化(n=10，±s)

與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;a表示為幾何均數×/÷耐受因子

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2.2 各組GRP78蛋白的表達 GRP78在對照組遠曲小管和集合管上皮細胞胞質中呈弱表達，在模型組表達增強，主要在近曲小管胞質中，部分腎小球細胞胞質也呈強陽性表達。與對照組相比，模型組大鼠GRP78蛋白在腎小球和腎小管－間質中表達明顯升高(P＜0.01)。與模型組相比，TGP各組大鼠GRP78在腎小球中表達低于模型組，但差異無統計學意義;但在腎小管－間質中表達明顯降低(P＜0.01)。見表2，圖1A1～E1。

表2 各組大鼠腎組織免疫組化指標GRP78變化(n=10，±s)

表2 各組大鼠腎組織免疫組化指標GRP78變化(n=10，±s)

與對照組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

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2.3 各組p-PERK蛋白的表達 p-PERK在對照組大鼠腎小管上皮細胞內呈弱表達，腎小球內無表達。與對照組相比，模型組大鼠p-PERK蛋白在腎小管上皮細胞胞質中表達明顯增強(P＜0.01)。與模型組相比，TGP各組p-PERK蛋白在腎小管－間質中表達明顯降低(P＜0.01)。見表3，見圖1A2～E2。

2.4 各組 p-eIF2α蛋白的表達 對照組 p-eIF2α蛋白少量表達于腎小球與腎小管－間質。與對照組相比，模型組大鼠p-eIF2α蛋白在腎小球及腎小管－間質中表達均顯著增加 (P＜0.01)。與模型組相比，TGP各組p-eIF2α蛋白在腎小球及腎小管－間質中表達均明顯降低 (P＜0.01)。見表4、圖1A3～E3。

圖1 各組腎組織中GRP78、p-PERK、p-eIF2α的表達 PV二步法×4001:GRP78;2:p-PERK;3:p-eIF2α;A:對照組;B:模型組;C:TGP 50 mg/(kg·d)組;D:TGP 100 mg/(kg·d)組;E:TGP 200 mg/(kg·d)組

表3 各組大鼠腎組織免疫組化指標p-PERK變化(n=10，±s)

表3 各組大鼠腎組織免疫組化指標p-PERK變化(n=10，±s)

與對照組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

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表4 各組大鼠腎組織免疫組化指標p-eIF2α變化(n=10，±s)

表4 各組大鼠腎組織免疫組化指標p-eIF2α變化(n=10，±s)

與對照組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

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3 討論

內質網穩態情況下，內質網膜上有3種ERS元件與內質網分子伴侶GRP78結合，這些蛋白分別是肌醇需求酶1，蛋白激酶樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)和活化轉錄因子6。ERS發生時，為使細胞適應應激，GRP78離開上述3種跨膜蛋白，觸發未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)［11］。PERK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，當未折疊蛋白及錯誤蛋白在內質網內腔內積聚時，PERK發生自身二聚化和磷酸化，繼而使eIF2α發生磷酸化，從而衰減大部分蛋白翻譯，消除不成熟蛋白，減輕內質網負荷［12］。

近年來越來越多的研究［13－14］顯示ERS與腎臟疾病聯系緊密。Lindenmeyer et al［15］以 DN 患者為研究對象，行腎穿刺或組織檢查，發現DN患者腎組織中UPR相關基因GRP78等的mRNA較對照組患者顯著增高，且ERS水平與DN的病變程度密切相關。另一研究中，研究者用STZ處理的9個月和22個月年齡的小鼠，經過4個月的DM病程后，這些小鼠出現蛋白尿，肌酐升高，腎小球硬化，腎小管炎癥浸潤和纖維化，同時糖尿病組小鼠腎組織中GRP78、CHOP、p-PERK 和 p-eIF2α 表達增加，而在22個月的小鼠中表達更加明顯［16］。

對腎組織中ERS的抑制可能延緩DN的發展。4-苯基丁酸是一種分子伴侶，研究者用4－苯基丁酸處理糖尿病大鼠，結果顯示用藥組UAER較糖尿病組顯著降低，同時腎組織中GRP78和p-PERK的表達較糖尿病組明顯降低，炎癥因子及纖維化因子也顯著降低［17］。國內也有動物模型實驗表明糖尿病大鼠腎小管中p-PERK和p-eIF2α較正常組增多，經血管緊張素轉換酶抑制劑治療可明顯降低二者的表達［18］。均提示中斷ERS反應在防治DN病程進展中具有重要的意義。

TGP為毛茛科植物芍藥的干燥根中提取的一組糖苷類物質，對T、B淋巴細胞的增殖有雙向調節作用，具有抗炎、抗氧化和免疫調節的作用，對類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡及免疫性肝損害等疾病有明確療效。大量國內研究［6－9］證實TGP對控制急慢性及免疫炎癥性疾病有明顯的作用，在對系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)大鼠的實驗研究中，發現TGP可以改善MsPGN大鼠腎小球系膜細胞增生和系膜基質聚積，同時減輕蛋白尿和血肌酐、尿素氮，提示TGP可以部分逆轉受損的腎小球病理改變［19］。該課題組前期研究［20－22］顯示 TGP既可減少 ICAM-1、IL-1及TNF-α，也可抑制氧化應激，從而推測TGP對糖尿病大鼠腎臟的保護反應與其抑制炎癥免疫反應及氧化應激有關。本實驗中，TGP給藥可以顯著降低模型組大鼠UAER，明顯減少腎組織中ERS相關蛋白 GRP78、p-PERK和 p-eIF2α的表達，提示TGP有保護DN大鼠腎臟的作用，并且可能與抑制DN大鼠腎組織中的UPR反應，抑制PERK-eIF2α通路有關。提示TGP對DN腎臟的保護作用可能與抑制ERS反應有關，但因ERS與炎癥反應通過一系列信號傳導通路包括產生活性氧、內質網鈣離子的釋放、核因子κB和有絲分裂原激活蛋白激酶等相互關聯［2］，其具體機制尚不明確，可在今后的研究中得以闡述。

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