穩(wěn)定期COPD患者外周血中Th17和Treg的表達及平衡關(guān)系變化

嚴 青，徐曉玲，夏淮玲，徐 飛，陳 軍，劉 輝，石建邦，李 慶

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)已經(jīng)成為全球第4位死亡原因，且逐年增加，預(yù)計到2020年將上升為全球第3位死亡原因和經(jīng)濟負擔(dān)的第5位［1］，目前普遍認為COPD是一種與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，發(fā)病機制未明確，近年的研究［2］提示COPD的發(fā)病可能與自身免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)。輔助性T細胞17(T help cell 17，Th17)和調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(T regular cell，Treg)均來源于CD4+T細胞，正常情況下促炎的Th17細胞和抑制性的Treg細胞之間保持平衡，維持機體免疫的穩(wěn)定［3］。該研究通過檢測穩(wěn)定期COPD患者外周血中Th17和Treg的表達及比值變化，探討Th17與Treg在COPD的發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2012年1月～2013年8月住院患者，根據(jù)肺功能及吸煙情況分為肺功能正常不吸煙組(A組)，肺功能正常吸煙組(B組)，穩(wěn)定期COPD組(C組);A組22例，B組22例，C組36例。

納入標(biāo)準:A組年齡40～80(46.59±14.40)歲和B組年齡40～80(56.73±11.76)歲，男女不限，肺功能正常，B組吸煙量≥200年支;C組年齡40～80(56.73±11.76)歲，男女不限，根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2009年修訂版)診斷標(biāo)準，吸入支氣管舒張劑后第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)＜70%且半年內(nèi)無急性發(fā)作史納入C組。排除標(biāo)準(滿足其中任1條):①處于急性發(fā)作期或者半年內(nèi)有急性發(fā)作史的COPD患者;②患有風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病或者自身免疫缺陷者或過敏性疾病;③1個月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素;④ 合并肺部及其他系統(tǒng)感染;⑤疑似或者確診惡性腫瘤患者。見表1。

表1 各組研究對象一般資料(±s)

表1 各組研究對象一般資料(±s)

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1.2 儀器與試劑 高速水平冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司);CO2培養(yǎng)箱(美國 Thermo scientific公司);流式細胞儀(美國BD公司);淋巴細胞分離液(北京索來寶公司);RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司);抗人CD4-FITC單克隆抗體、抗人IL-17-PE單克隆抗體、抗人CD25-PE單克隆抗體、抗人Foxp3-PECy5單克隆抗體、固定破膜劑及莫能霉素(Monensin)(美國 eBioscience公司);佛波酯(PMA)及離子霉素(ionomycin)(美國Enzo Life Science公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集和 PBMC的制備 抽取受試者清晨空腹靜脈血6 ml置2支肝素抗凝管中，PBS與血液等比稀釋，平鋪于淋巴分離液之上，離心后，提取白膜層至流式管中，加入PBS，離心，棄上清液。分別取100 μl至A管和B管將細胞濃度調(diào)整為2×106個/ml。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測Th17和Treg ① Th17將A管中加入RMPI 1640培養(yǎng)液、PMA(5 ng/ml)、ionomycin(500 ng/ml)、Monensin(2 μm/ml)置 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，加入PBS，離心，棄上清液，加入CD4-FITC，4℃避光孵育30 min，洗滌，棄上清液后加入破膜劑，避光孵育1 h，洗滌，棄上清液，加入IL-17-PE，避光孵育30 min，洗滌，棄上清液，上機檢測。② Treg將B管中加入CD4-FITC、CD25-PE，避光孵育30 min，洗滌，棄上清液，加入破膜劑，避光孵育1 h，洗滌，棄上清液，加入 Foxp3-PECy5，避光孵育1 h，洗滌，棄上清液，上機檢測。分析軟件為 Flow Jo7.6，應(yīng)用散點圖，設(shè)門，分析 Th17和 Treg占CD4+T細胞的百分比。

圖1 在外周血中Th17細胞表達流式散點圖

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用±s表示，多個樣本兩兩比較采用單因素方差分析。兩變量關(guān)聯(lián)性分析，吸煙量與Th17、Treg及 Th17/Treg相關(guān)性采用 Spearman相關(guān)，Th17、Treg、Th17/Treg 與 FEV1/預(yù)計值(%)及FEV1/FVC(%)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 3組外周血中Th17細胞的表達率 3組外周血中Th17細胞表達流式散點圖分析，見圖1。C組外周血Th17細胞的表達率(%)為(4.52±1.54)，明顯高于 B組(3.13±1.05)以及 A組(1.16±0.50)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);B組Th17細胞外周血中的表達高于A組(P＜0.01)。3組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

2.2 3組外周血中Treg細胞表達率 C組外周血中Treg細胞的表達率(%)是(5.10±1.36)，高于A組(2.10±0.87)(P＜0.01)和B組(4.15±0.96)(P＜0.01);B組高于A組(P＜0.01);3組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。3組外周血中Treg細胞表達流式散點圖分析見圖2。

2.3 3組之間Th17/Treg的比值差異 Th17/Treg

比值C組(0.98±0.50)明顯高于 A組(0.59±0.27)和B組(0.78±0.32)，A組和C組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，但A組與B組及B組與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組的Th17、Treg表達率以及Th17/Treg比值的比較(±s)

表2 各組的Th17、Treg表達率以及Th17/Treg比值的比較(±s)

與A組比較:☆☆P＜0.01;與B組比較:▲▲P＜0.01

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圖2 3組外周血中Treg細胞表達流式散點圖A:熒光扣除對照;B:肺功能正常不吸煙組;C:肺功能正常吸煙組;D:穩(wěn)定期COPD組

2.4 相關(guān)性分析 ①3組數(shù)據(jù)匯總分析外周血中Th17細胞和Treg細胞的表達與吸煙量呈正相關(guān)(r=0.50，r=0.65，P ＜0.01);Th17/Treg 的比值與吸煙量無明顯相關(guān)性(r=0.13，P ＞0.05)。② 3組數(shù)據(jù)分析Th17細胞與FEV1/預(yù)計值(%)(r=－0.38，P＜0.01)和FEV1/FVC(%)(r= －0.34，P＜0.01)呈負相關(guān);Treg細胞表達率與FEV1/預(yù)計值(%)(r=－0.65，P＜0.01)以及 FEV1/FVC(%)(r=－0.54，P ＜0.01)呈負相關(guān);Th17/Treg比值與FEV1/預(yù)計值(%)(r= －0.36，P ＜0.01)和 FEV1/FVC(%)(r= －0.34，P ＜0.01)呈負相關(guān)。

3 討論

已有研究［4］顯示僅在吸煙所致的COPD的患者的炎性特點是以CD8+Tc1淋巴細胞增加為主要表現(xiàn)。COPD小氣道壁上中性粒細胞、巨噬細胞、CD4細胞、CD8細胞、B細胞、淋巴濾泡增多，并且隨著COPD病情的嚴重程度加重而增加，這提示COPD存在著固有免疫和獲得性免疫的異常T淋巴細胞影響COPD的炎癥反應(yīng)［5］。

Th17是一個新的Th亞群，主要通過分泌IL-17發(fā)揮促炎功能，是Th17的主要效應(yīng)分子。Vargas-Rojas et al［6］研究發(fā)現(xiàn)COPD患者外周血中Th17細胞數(shù)高于吸煙者和健康對照者，并與FEV1/預(yù)計值(%)和FEV1/FVC(%)呈反比，并隨著氣流受限的程度加重，Th17的細胞數(shù)也隨之增加，與本研究結(jié)果相一致。Harrison et al［7］在動物試驗中發(fā)現(xiàn)長期暴露于香煙煙霧后肺組織內(nèi)的IL-17含量明顯升高，小鼠肺上皮細胞大量分泌IL-17能夠引起類似于COPD的肺部感染。這提示Th17在吸煙引起的肺氣腫的免疫應(yīng)答中起著重要作用。

Tregs是一群具有抑制功能的T細胞亞群，其抑制效應(yīng)性T細胞的增殖、激活以及B細胞產(chǎn)生免疫球蛋白等。本研究結(jié)果顯示與肺功能正常不吸煙組和肺功能正常吸煙組比較，穩(wěn)定期COPD組的外周血中Treg百分比增加，并與FEV1/預(yù)計值(%)和FEV1/FVC(%)呈反比，與吸煙量呈正比，且肺功能正常吸煙組中的Treg的表達率高于不吸煙組。本實驗與Smyth et al［8］研究結(jié)果相一致:健康吸煙組和COPD組的肺泡灌洗液中的Treg表達是上調(diào)的，且Foxp3 T細胞數(shù)與吸煙量呈正相關(guān)。在COPD患者和肺功能正常的吸煙組的外周血中的Treg表達率也是增加的［6］。由此推測，煙草成分直接刺激或持續(xù)性炎癥反應(yīng)的產(chǎn)物有關(guān)。COPD是一種慢性氣道炎癥，在COPD的穩(wěn)定期，Treg處于高表達狀態(tài)可能與其持續(xù)發(fā)揮抗炎作用有關(guān)。

Th17和Treg細胞均來源于初始T細胞，促炎的Th17細胞和抗炎的Treg細胞在分化和功能上相互制約，正常生理情況下二者保持平衡才能保持機體的穩(wěn)態(tài)，一旦這種平衡被打破就會導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)失常，引起疾病的發(fā)生，如感染、腫瘤及自身免疫性疾病。本實驗結(jié)果顯示COPD組Th17/Treg的比值明顯高于肺功能正常不吸煙組，并與吸煙量呈正相關(guān)，與肺功能呈負相關(guān)。雖然COPD患者外周血中的Th17和Treg均是上調(diào)的，但是這種上調(diào)更傾向于Th17細胞，Th17的增加幅度高于Treg，這表明Th17的促炎比Treg的抗炎功能強，Treg上調(diào)不足，來不及有效的抑制炎癥，最終導(dǎo)致Th17和Treg細胞之間的平衡被打破，使得氣道內(nèi)的炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，這種Th17/Treg失衡在COPD的動物模型中也得出相同的結(jié)論［9］。因此，這進一步為COPD的發(fā)病存在自身免疫應(yīng)答的假說提供了依據(jù)，也為未來COPD新的治療方案的發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)一個新的方向。

［1］Rabe K F，Hurd S，Anzueto A，et al.Global strategy for the diag-nosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease:GOLD executive summary［J］.Am J Respir Crit Care Med，2007，176(6):532 －55.

［2］Agusti A，MacNee W，Donaldson K，et al.Hypothesis:does COPD have an autoimmune component?［J］.Thorax，2003，58(10):832－4.

［3］Heo Y J，Joo Y B，Oh H J，et al.IL-10 suppresses Th17 cells and promotes regulatory T cells in the CD4+T cell population of rheumatoid arthritis patients［J］.Immunol Lett，2010，127(2):150 －6.

［4］Barnes P J，Shapiro S D，Pauwels R A.Chronic obstructive pulmonary disease:molecular and cellular mechanisms［J］.Eur Resprit J，2003，22(4):627 －88.

［5］Hogg J C，Chu F，Utokaparch S，et al.The nature of small-airway obstruction in chronic obstruction pulmonary disease［J］.N Engl J Med，2004，350(26):2645 －53.

［6］Vargas-Rojas M I，Ramírez-Venegas A，Limón-Camacho L，et al.Increase of Th17 cells in peripheral blood of patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］.Respir Med，2011，105(11):1648－54.

［7］Harrison O J，F(xiàn)oley J，Bolognese B J，et al.Airway infiltration of CD4+CCR6+Th17 type cells associated with chronic cigarette smoke induced airspace enlargement［J］.Immunol Lett，2008，121(1):13－21.

［8］Smyth L J，Starkey C，Vestbo J，et al.CD4-regulatory cells in COPD patients［J］.Chest，2007，132(1):156 － 63.

［9］Wang H，Peng W，Weng Y，et al.Imbalance of Th17/Treg cells in mice with chronic cigarette smoke exposure［J］.Int Immunopharmacol，2012，14(4):504 －12.