不同方法接種構建的SCID小鼠HL-60白血病模型生物學特性分析

單武林，章成芳，馬筱玲，常文嬌，戴媛媛

白血病是一類嚴重威脅人類健康和生命的常見疾病［1］。由于傳統的化療藥物治療一般伴有嚴重的毒副反應而不能達到有效的治療作用。所以，新型抗腫瘤藥物的研發依舊是目前研究的熱點［2］。盡管人白血病細胞能夠在體外分離并用于研究，但是仍有許多問題需要通過體內試驗來驗證。因此，建立一個穩定的動物模型用于新型抗白血病藥物的研究具有重要意義［3］。自從1983年美國學者Bosma發現SCID小鼠以來，人們便將這類小鼠廣泛用于白血病的研究。大量的研究［4－6］表明人白血病細胞可在這類小鼠體內廣泛生長并擴散。通常主要采用以下幾種方法構建小鼠白血病模型，主要包括:皮下、腹腔和靜脈注射［4，7－8］。該研究選擇皮下及腹腔2種途徑接種構建HL-60白血病小鼠模型，并進一步比較兩種模型的生物學特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人急性髓系白血病細胞株HL-60購于中國科學院上海細胞研究所。在細胞培養箱中常規傳代，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(100 U/ml青霉素 G、100 μg/ml鏈霉素和 2 g/L 碳酸氫鈉)培養，并置于5%CO2、37℃培養箱培養。

1.1.2 實驗動物 SCID小鼠，雄性，清潔級，體重17～20 g，3～4周齡(購于北京華阜康公司)，飼養于安徽醫科大學清潔級實驗動物房帶蓋鼠盒中(符合SPF標準)。室內空氣經有效過濾。飲用水酸化處理pH 4～5。標準顆粒飼料，墊料及一切與鼠接觸物品均滅菌處理。

1.1.3 主要試劑 小鼠抗人CD33單抗購于美國BIOSS公司;紅細胞裂解液購于加拿大Stem Cell Technologies公司;抗人CD33-PE標記和陰性對照羊抗小鼠IgG-PE標記購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 急性髓系白血病SCID小鼠模型的建立SCID小鼠于移植前連續2 d腹腔注射環磷酰胺(CTX，100 mg/kg體重)。第2次注射CTX 24 h以后，將小鼠隨機分為A、B和C 3組，每組8只。取對數生長期HL-60細胞，分別以右側腹部皮下單點注射(A組)1×107/鼠，腹腔注射(B組)1×107/鼠接種于小鼠。C組小鼠不做處理作正常對照。如果小鼠出現以下癥狀將其處死，包括:下肢癱瘓;體重下降＞20%;小鼠縮成一團;垂死的狀態。

1.2.2 外周血白細胞及分類計數 接種細胞后，每周取尾靜脈血檢測。采用人工法計數外周血白細胞數。

1.2.3 病理和免疫組織化學檢查 瀕死動物進行病理檢查，取肝和脾，以10%甲醛固定48 h以上，常規石蠟切片，HE染色后鏡檢。免疫組化檢測:石蠟切片經脫蠟、脫水，抗原熱修復后，加小鼠抗人CD33單抗，生物素標山羊抗小鼠IgG，辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素。

1.2.4 流式細胞分析儀檢測CD33陽性率 CD33為一跨膜糖蛋白，在HL-60細胞上，CD33表達陽性率可達99%。CD33陽性率可作為模型腫瘤浸潤的重要指標。取瀕死小鼠外周血，紅細胞裂解液去除外周血中的紅細胞，制備細胞懸液備用。另取肝脾組織，制備組織單細胞懸液備用。將處理完畢的單細胞懸液加抗人CD33-PE，陰性對照羊抗小鼠IgGPE標記，4℃避光染色30 min，再經PBS洗2次，上流式細胞儀(FAcscan，美國BD)。Cell quest軟件分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0和Photoshop軟件進行統計分析。數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組生存分析采用t檢驗。

2 結果

2.1 HL-60白血病SCID小鼠模型 兩種接種方法都能夠成功構建小鼠白血病模型。在A組，所有小鼠在16 d內形成了肉眼可見的皮下腫瘤，平均成瘤時間為(12.15±3.26)d;所有小鼠在66 d內死亡，平均生存時間為(53.24±10.33)d。在B組，6只小鼠在25 d內形成了肉眼可見的腹腔腫瘤，平均成瘤時間為(19.00±5.84)d;這6只小鼠在53 d內全部死亡，平均生存時間為(36.87±10.22)d。見圖1。另外2只沒有形成腹腔腫瘤的小鼠沒有死亡。形態學檢測發現B組小鼠肝脾腫大較A組小鼠明顯。另外，B組小鼠腹腔形成腹水，而A組沒有腹水形成。

圖1 兩組小鼠的生存曲線

2.2 小鼠外周血和臟器中腫瘤浸潤情況 接種細胞后，每周取尾靜脈血檢測外周血白細胞數。在同一時間，A、B兩組小鼠外周血白細胞數高于C組，且B組小鼠白細胞數升高比A組快。從第4周開始，B組小鼠外周血白細胞數較A、C兩組明顯升高，差異有統計學意義(F=7.53，P ＜0.05)，見表1。流式檢測結果顯示兩組小鼠外周血均有白血病細胞浸潤，但是比例較低，不超過3%。A、B兩組小鼠外周血中白血病細胞平均比例分別為(1.72±1.07)%和(2.65±1.36)%，見圖4。HE和免疫組織化學用于檢測肝脾腫瘤浸潤情況。B組小鼠臟器浸潤比A組嚴重。B組小鼠的肝脾都有大量白血病細胞浸潤并伴隨著結構的嚴重破壞。在A組中，脾有白血病細胞并伴隨著結構的破壞，然而肝臟很少能檢測到白血病細胞浸潤且幾乎檢測不到結構的破壞，見圖2、3。另外，采用流式檢測肝脾單細胞懸液中CD33陽性的白血病細胞比例。A組小鼠肝、脾白血病細胞比例為(1.83±1.15)%和(8.54±3.79)%，B組小鼠肝、脾白血病細胞比例為(6.93±3.15)%和(12.16±4.63)%，見圖4。流式結果進一步證明了B組小鼠臟器浸潤破壞較A組明顯。

3 討論

白血病是一類造血干細胞異常的克隆性惡性疾病，克隆中的白血病細胞失去進一步分化成熟能力而停滯在細胞發育的不同階段［9］。近年來，盡管在白血病治療方面有了很大進步，但治療效果及預后并不理想［10］。探索新的、更加經濟、有效的靶向治療方法是臨床醫學的迫切需要。新型治療藥物需要在動物模型中驗證其生物學效應。因此，需要建立穩定的動物模型用于新型藥物抗白血病研究。

本研究顯示，兩種接種方法均可成功構建HL-60小鼠白血病模型。皮下接種出現肉眼可見的瘤體時間早于腹腔接種。A組成瘤率為100%，B組成瘤率為75%。以下幾個因素影響人白血病細胞成功移植于小鼠體內。首先，移植成功率與人白血病細胞的生物學特性和細胞FAB類型有關。用從小鼠腹水中取出的白血病細胞接種有較高的移植成功率。因為腹水中的白血病細胞已經適應了小鼠的體內環境，易于其生長擴散。M2和M3移植成功率比其他細胞類型低。Rombouts et al［11］研究發現M0比M2、M4以及M5移植成功率高。其次，移植成功率與SCID小鼠的特性有關。SCID小鼠雖然有嚴重的聯合免疫缺陷，但體內仍有著自然殺傷細胞(NK)細胞、粒細胞以及單核細胞的活性。隨著細胞周期的延長，其他的免疫活性也會重建［12］。研究［13］顯示對于＞5周齡的小鼠，必須經過預處理來克服或突破剩余的免疫防御系統來提高移植成功率。給予SCID小鼠額外的生長刺激，包括IL-3、IL-6和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子等，能提高白血病細胞的移植成功率。采取適當的方法去除SCID小鼠體內的NK細胞也能夠提高移植成功率。另外，白血病細胞移植成功率與患者預后有關。研究［14］表明預后較差患者的白血病細胞具有較高的移植成功率。

表13 組小鼠外周血中白細胞數(×109/L，±s)

表13 組小鼠外周血中白細胞數(×109/L，±s)

與A組比較:*P＜0.05;與C組比較:△P＜0.05;在第7、8周B組小鼠已經死亡

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圖2 各組小鼠肝臟HE和免疫組化染色結果 ×400

圖3 各組小鼠脾HE和免疫組化染色結果 ×400

圖4 各組小鼠外周血、肝和脾細胞懸液中白血病細胞比例

在存活時間方面，腹腔接種組小鼠存活時間較皮下注射組短。兩種接種途徑均可引起小鼠外周血白細胞升高，腹腔接種組外周血白細胞數上升速度較皮下接種組快。從接種后第4周開始，兩組之間白細胞數目差異有統計學意義。這也能解釋為什么腹腔接種組小鼠生存時間比皮下接種組短。兩組小鼠外周血中都檢測到白血病細胞，但是白血病細胞的比率較低，不超過3%，這與 Lord et al［15］研究結果一致。另外，本研究結果顯示腹腔接種組小鼠臟器浸潤較為嚴重。

總之，經皮下、腹腔兩種途徑接種HL-60細胞均可成功構建小鼠白血病模型。皮下注射成瘤時間短，存活時間長，可見明顯的瘤結節;皮下接種腫瘤細胞具有操作簡單、重復性好和易于觀察等優點，因而可通過觀察和測量皮下腫瘤的體積大小和重量，分析藥物抗白血病療效。腹腔注射成瘤時間長，存活時間短;利用腹腔接種的方法，可更好的了解白血病細胞在臟器中的浸潤和轉移情況。當然，如果希望充分的了解一種藥物的療效，最好同時采用兩種小鼠模型來檢測其抗白血病作用。

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