二烯丙基二硫?qū)θ宋赴㎝GC803細(xì)胞Rac1-Pak1／Rock1通路的影響

何 慧，馬艷華，2，蘇 波，向姝霖，姜 浩，楊邦敏，章 碩，夏 紅，蘇 琦

（1.湖南省胃癌研究中心，南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，腫瘤研究所，湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點實驗室，湖南衡陽 421001；2.海南省第三人民醫(yī)院，海南三亞 572009）

二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）是大蒜烯丙基硫化物中的一種脂溶性有效成分，具有多種抗腫瘤作用［1］。本實驗室先前工作證明，DADS可抑制人胃癌細(xì)胞增殖抑制與誘導(dǎo)分化［2－6］。最近，我們報道DADS可抑制人胃癌細(xì)胞遷移侵襲，且能下調(diào)LIMK1、MMP-9，上調(diào) TIMP-3，提示 DADS抗胃癌細(xì)胞遷移侵襲與干預(yù) Rac1／LIMK1通路有關(guān)［7－8］。在前期工作的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討DADS對LIMK1上游信號分子Rac1-Pak1／Rock1的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人胃癌MGC803細(xì)胞系南華大學(xué)腫瘤研究所保存。培養(yǎng)于10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的恒濕培養(yǎng)箱中，2 d傳代1次。

1.2 試劑 DADS：Fluka公司產(chǎn)品，純度80%，與Tween 80以1∶2比例充分溶解，加入體積分?jǐn)?shù)為0.90的生理鹽水稀釋100倍，作為母液保存于－20℃冰箱中。小牛血清（杭州四季青生物工程公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司），Total RNA Kit（Omega公司），RT試劑盒（Invitrogen公司），PCR試劑（Promega公司）。BCA蛋白定量檢測試劑盒（Pierce公司），ECL發(fā)光檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），cofilin1、Phospho-cofilin1多克隆抗體（ABZOOM公司）。Rac1單克隆抗體（MILLIPORE公司），ROCK1與PAK1單克隆抗體（Epitomics公司），Destrin多克隆抗體（Abcam公司）。羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（KPL公司）。

1．3 RT-PCR Total RNA Kit提取細(xì)胞總RNA，在AMV酶作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計并合成PCR擴(kuò)增引物。Rac1：F 5′-CCCTATCCTATCCGCAAACA-3′，R 5′-CGCACCTCAGGATACCACTT-3′，擴(kuò)增片段100 bp；Pak1：F 5′-AAGACATCCAACAGCCAGAA-3′，R 5′-TGTAGCCACGTCCCGAGT-3′，擴(kuò)增片段 255 bp；Rock1：F 5′-AAAACCTTATTTGTGCCTTCC-3′，R 5′-CGTTTCCCAAGCCCACT-3′，擴(kuò)增片段 113 bp；cofilin1：F 5′-CAAGAAGGCGGTGCTCT-3′，R 5′-ACAA AGGTGGCGTAGGG-3′，擴(kuò)增片段 120 bp；Destrin：F 5′-TGGTTGGAGATGTTGGTG-3′，R 5′-TACAAGCCC GATTGAGAT-3′，擴(kuò)增片段 276 bp；β-actin：F 5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3′，R 5′-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3′，擴(kuò)增片段 367 bp。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照，AlphaImager 2200軟件掃描，相對光密度（ROD）代表基因表達(dá)豐度，以 LIMK1／β-actin表達(dá)豐度計算平均光密度值。

1．4 Western blot 收集細(xì)胞，冰PBS洗兩次，1×107個細(xì)胞加入 100μl裂解液（100 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.6，1 mmol·L－1EDTA pH 8.0，1 mg·L－1Aprotinin，100 mg·L－1PMSF），冰上裂解 1 h，12 000 r·min－1離心 10 min，吸出上清液，即細(xì)胞總蛋白。Bradford法測定蛋白含量，分光光度計在570nm波長處測定光吸收值，以溶劑為空白對照，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算蛋白含量。使蛋白變性，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含5%牛血清白蛋白的 TBST（Tris-HCl 20 mmol·L－1，NaCl 137 mmol·L－1含 0.1%Tween-20）封閉 1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑檢測蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測定光密度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件One-Way Anova或t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2．1 DADS對人胃癌MGC803細(xì)胞Rac1表達(dá)的影響 如 Fig 1所示，用30 mg·L－1DADS處理MGC803細(xì)胞12h，Rac1 mRNA水平與對照組（0 h組）差異無顯著性，而 DADS作用細(xì)胞 48h后，Rac1mRNA水平明顯下調(diào)（P＜0.01）；Western blot檢測結(jié)果顯示，用DADS處理細(xì)胞12和24 h，Rac1蛋白水平無明顯改變，而在36和48 h時則明顯下調(diào)（P＜0.05）。以上結(jié)果表明DADS處理細(xì)胞24 h后，對Rac1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)具有抑制作用。

2．2 DADS對人胃癌MGC803細(xì)胞Pak1表達(dá)的影響 如Fig 2所示，與對照組比較，用30 mg·L－1DADS處理MGC803細(xì)胞12 h，Pak1 mRNA水平無變化，而在48 h時則明顯下降（P＜0.01）；Pak1的蛋白表達(dá)在12 h無明顯改變，而在處理細(xì)胞24、36和48 h時，其蛋白表達(dá)呈時間依賴性降低（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，DADS可下調(diào)Pak1基因與蛋白表達(dá)。

2．3 DADS對人胃癌MGC803細(xì)胞Rock1表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，DADS處理細(xì)胞12和48 h，Rock1 mRNA水平均下降（P＜0.01）（Fig 3A）；Rock1蛋白水平在24、36和48 h時呈時間依賴性下降（P＜0.01）（Fig 3B），表明DADS同樣可抑制Rock1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。

Fig 1 Effects of DADS on Rac1 mRNA and protein levels in MGC803 cells

2．4 DADS對人胃癌MGC803細(xì)胞cofilin1表達(dá)的影響 DADS處理MGC803細(xì)胞12和48 h后，cofilin1 mRNA水平與對照組比較，差異沒有顯著性（P＞0.05）（Fig 4A）。cofilin1蛋白水平在 12、24、36和48 h處理后差異也無顯著性（P＜0.05），但磷酸化cofilin1水平則在DADS處理細(xì)胞24、36和48 h后呈時間依賴地下降（P＜0.01）（Fig 4B），表明DADS可抑制MGC803細(xì)胞cofilin1的磷酸化。

Fig 2 Effects of DADS on Pak1 mRNA and protein levels in MGC803 cells

Fig 3 Effects of DADS on Rock1 mRNA and protein levels in MGC803 cells

2．5 DADS對人胃癌MGC803細(xì)胞destrin表達(dá)的影響 如Fig 5所示，與對照組比較，DADS處理MGC803細(xì)胞后，destrin在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平變化均無顯著性（P＞0.05），表明DADS對destrin表達(dá)無影響。

3 討論

Rho GTPase-Pak／Rock-LIMK信號通路主要參與肌動蛋白功能和細(xì)胞骨架重組的調(diào)節(jié)，與腫瘤細(xì)胞遷移侵襲關(guān)系密切。Rho GTPase家族分子中研究較多的是Rac1，它可通過活化Pak或Rock而激活下游LIMK，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［9－10］。例如，表皮生長因子受體 HER2可通過激活 Rac1／Pak1通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲［11］；而下調(diào)Rac1／Pak1通路能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力［12］。

LIM激酶（lim kinase，LIMKs）是一類直接調(diào)控ADF（Destrin）／cofilins功能的分子。LIMK家族包括LIMK1和LIMK2，其中LIMK1主要與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［13］。LIMK1表達(dá)或活性增強(qiáng)可導(dǎo)致磷酸化ADF／cofilins水平升高，從而增加肌動蛋白聚合，促進(jìn)細(xì)胞偽足形成，驅(qū)動腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲［9］。干擾LIMK1表達(dá)可抑制cofilin1磷酸化及腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［14］。我們先前報道，LIMK1在胃癌組織中高表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［15］，而DADS抑制胃癌細(xì)胞遷移侵襲與其下調(diào)LIMK1有關(guān)［8］。最近的研究發(fā)現(xiàn)［16］，Rac1、Pak1和 Rock1在胃癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織與非典型增生組織，并且三者的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)，表明Rac1、Pak1和Rock1高表達(dá)與胃癌發(fā)生、臨床進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

Fig 4 Effects of DADSon cofilin1 mRNA and protein levels in MGC803 cells

Fig 5 Effects of DADS on destrin mRNA and protein levels in MGC803 cells

為了闡明DADS抗人胃癌細(xì)胞遷移侵襲作用是否還與其干預(yù)LIMK1上游信號分子有關(guān)，我們進(jìn)一步研究DADS對LIMK1上游的信號分子表達(dá)的影響。本研究結(jié)果顯示，DADS可下調(diào)Rac1、Pak1和Rock1的 mRNA和蛋白水平，表明 DADS能抑制Rac1、Pak1和Rock1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。同時我們發(fā)現(xiàn)DADS對LIMK1下游分子cofilin1和destrin的表達(dá)沒有影響，但DADS可下調(diào)磷酸化cofilin1水平。我們在結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，DADS可下調(diào)Rac1、Pak1、Rock1和 LIMK1的表達(dá)，降低 destrin表達(dá)和cofilin1的磷酸化，并且DADS下調(diào)Rac1-Pak1／Rock1-LIMK1通路的作用與其抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)［17］。因此，結(jié)合之前發(fā)現(xiàn)DADS可下調(diào)LIMK1表達(dá)的結(jié)果［8］，我們分析DADS可能通過抑制Rac1-Pak1／Rock1-LIMK1通路分子的表達(dá)，導(dǎo)致cofilin1磷酸化減少，這一作用可能與DADS抑制胃癌細(xì)胞遷移侵襲能力有關(guān)。

綜上所述，DADS不僅可下調(diào)LIMK1，而且還可通過其上游Rac1-Pak1／Rock1通路分子的表達(dá)，抑制cofilin1的磷酸化，從而抑制人胃癌細(xì)胞遷移與侵襲，表明DADS抑制人胃癌細(xì)胞遷移侵襲作用的分子機(jī)制與阻斷Rac1-Pak1／Rock1通路密切相關(guān)。

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