HPLC法檢查環(huán)戊丙酸雌二醇原料藥的有關(guān)物質(zhì)

杜碧瑩（廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣州 510160）

環(huán)戊丙酸雌二醇為長(zhǎng)效雌激素，其作用比戊酸雌二醇強(qiáng)而持久，維持時(shí)間在3～4周以上，臨床上主要用于卵巢功能不全、閉經(jīng)、更年期綜合征、老年性陰道炎及前列腺癌等；其與甲羥孕酮組成復(fù)方注射用避孕藥（全球通用藥名Lunelle），可作為每月1次長(zhǎng)效避孕劑，已獲美國(guó)FDA認(rèn)可[1-2]。環(huán)戊丙酸雌二醇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅在《美國(guó)藥典》（USP）36版[3]有收載，2010年版《中國(guó)藥典》以及現(xiàn)行版《英國(guó)藥典》《歐洲藥典》《日本藥局方》均無(wú)收載。而目前USP 36版及國(guó)內(nèi)研究并沒(méi)有對(duì)環(huán)戊丙酸雌二醇的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行定性定量研究，因此難以保證藥品質(zhì)量。本文建立了新的有關(guān)物質(zhì)檢查方法，并通過(guò)測(cè)定不同濃度雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雜質(zhì)校正因子，從而提高了有關(guān)物質(zhì)控制的準(zhǔn)確性，以更好地對(duì)環(huán)戊丙酸雌二醇的質(zhì)量情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜（HPLC）儀系統(tǒng)、紫外檢測(cè)器、Chem Station工作站（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

環(huán)戊丙酸雌二醇（USP對(duì)照品，批號(hào):CAT NO.1252003，純度:99.9%，105 ℃干燥4 h后用）；雜質(zhì)Ⅰ[雌甾-1，3，5（10）-三烯-3，17-二醇，（17β）-，17-環(huán)戊乙酸酯，企業(yè)工作對(duì)照品，批號(hào):ZP034-S003，純度:99.28%）；雜質(zhì)Ⅱ[雌甾-1，3，5（10），9（11）-四烯-3，17-二醇，（17β）-，17-環(huán)戊丙酸酯，企業(yè)工作對(duì)照品，批號(hào):ZP034-S002，純度:98.58%）；環(huán)戊丙酸雌二醇原料藥（北京某公司，批號(hào):20110941、20110942、20110943，純度:100.9%、99.9%、99.8%）；乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18（以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，25 cm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:硝酸銨溶液（取0.8 g硝酸銨，溶解于300 ml水中）-乙腈（23∶77，V/V），流速:1.5 ml/min；柱溫:35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm；進(jìn)樣量:50 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液。取環(huán)戊丙酸雌二醇原料藥適量，精密稱定，加溶劑[乙腈-水（70∶30）]溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 對(duì)照溶液。精密量取供試品溶液適量，加溶劑稀釋制成每1 ml中約含1 μg的溶液，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液。取雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌愤m量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含2 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取環(huán)戊丙酸雌二醇USP對(duì)照品、雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌愤m量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1 ml中含1 mg、1.5 μg、2 μg的混合溶液。取50 μl，注入液相色譜儀，環(huán)戊丙酸雌二醇的保留時(shí)間約為20 min；環(huán)戊丙酸雌二醇峰與雜質(zhì)Ⅱ的分離度應(yīng)大于2.0，理論板數(shù)按環(huán)戊丙酸雌二醇峰計(jì)不低于5000。系統(tǒng)適用性溶液和供試品溶液（批號(hào):20110941）色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.系統(tǒng)適用性溶液；B.供試品溶液；1.雜質(zhì)Ⅰ；2.雜質(zhì)Ⅱ；3.環(huán)戊丙酸雌二醇Fig 1 HPLC chromatogramsA.system suitability solution；B.test solution；1.impurityⅠ；2.impurityⅡ；3.estradiol cypionate

2.4 不同色譜柱試驗(yàn)

比較了不同牌號(hào)的色譜柱對(duì)分析的影響，各指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同色譜柱試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of tests under different columns

試驗(yàn)結(jié)果表明該流動(dòng)相適用范圍較廣，選擇3種不同牌號(hào)的色譜柱均可適用，雜質(zhì)Ⅱ與環(huán)戊丙酸雌二醇的分離度均大于2.0。

2.5 線性關(guān)系試驗(yàn)

分別取環(huán)戊丙酸雌二醇、雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌愤m量，用溶劑稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml，0.3、0.6、0.9、1.5、2.0 μg/ml，0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/ml的系列溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程，見(jiàn)表2。

表2 線性方程結(jié)果Tab 2 Linear equation

按最小二乘法以進(jìn)樣量對(duì)響應(yīng)值（峰面積等）進(jìn)行線性回歸，求得兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩曲線斜率之比即為校正因子。雜質(zhì)Ⅰ相對(duì)校正因子為0.970，雜質(zhì)Ⅱ相對(duì)校正因子為0.368。

2.6 耐用性試驗(yàn)

比較了不同流動(dòng)相組成比例、pH、柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)等對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，見(jiàn)表3。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of durability test

結(jié)果顯示，雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ的相對(duì)保留時(shí)間比較穩(wěn)定，雜質(zhì)Ⅱ與環(huán)戊丙酸雌二醇的分離良好。計(jì)算得雜質(zhì)Ⅰ的相對(duì)響應(yīng)因子為0.9～1.0，雜質(zhì)Ⅱ的相對(duì)響應(yīng)因子為0.3～0.4，受參數(shù)變化影響較小。擬定標(biāo)準(zhǔn)雜質(zhì)Ⅰ按不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算，以相對(duì)主峰的保留時(shí)間進(jìn)行定性；雜質(zhì)Ⅱ采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法進(jìn)行定量（與加校正因子主成分自身對(duì)照法計(jì)算的結(jié)果一致，見(jiàn)“2.11”項(xiàng)）。

2.7 精密度試驗(yàn)

分別取“2.5”項(xiàng)下環(huán)戊丙酸雌二醇（1.0 μg/ml）、雜質(zhì)Ⅱ（2.0 μg/ml）對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，環(huán)戊丙酸雌二醇、雜質(zhì)Ⅱ峰面積變化的RSD分別為0.1%、0.4%（n＝6）。

取供試品溶液（批號(hào):20110941）連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的RSD為0.2%（n＝6）。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（批號(hào):20110941）放置0、8、16、24 h時(shí)取樣測(cè)定，峰面積的RSD為0.5%（n＝4）。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 雜質(zhì)Ⅱ測(cè)定的準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別精密稱取環(huán)戊丙酸雌二醇原料藥（批號(hào):20110941）9份，每份100 mg，置于100 ml量瓶中，精密加入雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌焚A備液（20 μg/ml）4、5、6 ml，加溶劑溶解并稀釋至刻度，測(cè)定高、中、低3種質(zhì)量濃度的回收率，結(jié)果平均值分別為98.86%、99.92%、100.07%，總平均回收率為99.62%，RSD為0.6%（n＝9）。

2.10 雜質(zhì)檢測(cè)限與定量限試驗(yàn)

取“2.5”項(xiàng)下溶液適量，采用逐步稀釋法稀釋，當(dāng)信噪比為3時(shí)，雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ與環(huán)戊丙酸雌二醇檢測(cè)限分別為6.3、1.5、2.3 ng；當(dāng)信噪比為10時(shí)，雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ與環(huán)戊丙酸雌二醇定量限分別為21.0、5.0、7.7 ng。

2.11 樣品中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

量取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液、對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液各50 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的3倍，供試品溶液如有與雜質(zhì)Ⅱ保留時(shí)間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過(guò)0.2%；在相對(duì)保留時(shí)間為0.7處如有雜質(zhì)峰（雜質(zhì)Ⅰ），不得大于對(duì)照溶液主峰峰面積的1.5倍（0.15%）；其他單個(gè)雜質(zhì)不得大于對(duì)照溶液主峰峰面積（0.1%），雜質(zhì)總量不得過(guò)1.0%。供試品溶液中任何小于對(duì)照溶液主峰面積0.1倍的峰可忽略不計(jì)。3批樣品有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3批樣品有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果（%）Tab 4 Results of related substances in 3 batches of samples（%）

3 討論

（1）本試驗(yàn)中取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液進(jìn)樣，用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）檢測(cè)，環(huán)戊丙酸雌二醇、雜質(zhì)Ⅰ及單個(gè)雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，雜質(zhì)Ⅱ的最大吸收波長(zhǎng)為263 nm。擬定標(biāo)準(zhǔn)采用280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。由于雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ的相對(duì)保留時(shí)間重現(xiàn)性較好，雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ的相對(duì)響應(yīng)因子受參數(shù)變化影響較小，故雜質(zhì)Ⅰ按不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算，以相對(duì)主峰的保留時(shí)間進(jìn)行定性。雜質(zhì)Ⅱ采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法與外標(biāo)法計(jì)算的結(jié)果一致，由于雜質(zhì)Ⅱ易于獲得，且經(jīng)結(jié)構(gòu)確證且純度大于98.5%，故擬定標(biāo)準(zhǔn)采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法進(jìn)行定量。

（2）筆者曾采用梯度洗脫的方式進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，由于不同的儀器間梯度準(zhǔn)確度的差異會(huì)導(dǎo)致分離重現(xiàn)性差；而等度洗脫的方式重現(xiàn)性較好，各有關(guān)物質(zhì)間的分離度均＞2.0，有關(guān)物質(zhì)的定量準(zhǔn)確度也不受影響，因此本試驗(yàn)最終采用等度洗脫的方式。

（3）環(huán)戊丙酸雌二醇是以雌酚酮與環(huán)戊丙酰氯為起始原料，通過(guò)一系列酯化及水解后的終產(chǎn)物。環(huán)戊丙酰氯中含有微量環(huán)戊乙酰氯，與雌酚酮的反應(yīng)副產(chǎn)物為雜質(zhì)Ⅰ，雜質(zhì)Ⅱ?yàn)榇品油摎湮铮ù品油按萍に匮苌锏暮铣芍惺褂枚榷杌锦摎鋄4]）與環(huán)戊丙酰氯的反應(yīng)副產(chǎn)物。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3批樣品中均檢出雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ，但未檢出另一已知雜質(zhì)雌二醇。

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