石油輸入對河口蘆葦濕地根際微生物的影響

田偉君,王勇梅,孫會梅,趙陽國,2,白 潔,2,吳承林 (.中國海洋大學環境科學與工程學院,山東 青島26600；2.海洋環境與生態教育部重點實驗室,山東 青島 26600)

河口濕地是陸地和海洋生態系統之間重要的過渡帶,由陸源產生的營養物質和有機有毒性物質在通過河口濕地進入海洋時經歷了生物、地質及水文等因子的共同作用,經過各種物理、化學過程得到凈化.無論是對地表水和海水,它都起到一定的滯留作用,是保護海洋生態系統免受來自陸源污染的最后一道屏障[1-2].但作為陸海相互作用的集中地帶,河口濕地生態系統也相對敏感脆弱.近年來,外源污染物不斷輸入,對濕地生態系統的穩定已經形成潛在危害.尤其是我國河口濕地分布著許多大型油田(如遼河油田,勝利油田等),油田開發強度大、井噴油管破裂、原油泄漏、油井鉆探等使河口濕地普遍存在不同程度的石油污染,嚴重威脅到濕地生態系統的健康發展[3].

土壤微生物群落是濕地生態系統的重要組成部分,在濕地凈污過程中發揮重要的作用[4-6].絕大多數有機物的降解、氮磷硫物質的生物地球化學循環等都是微生物在群落水平,通過各種單一功能的種群依次梯級作用實現的[7-8],某種或某類微生物的數量或活性的消長都會直接影響到群落功能的完成,最終導致生態系統的失衡甚至破壞.因此,已有一些學者研究石油污染物的輸入對微生物群落的影響,但主要是分析石油污染物對農業、林地和草地土壤及植物根際微生物群落的影響[9-16],而對河口濕地微生物群落影響的研究則較少,主要原因一方面是輸入河口濕地的污染物種類繁多,模擬分析設備環境條件控制困難,且在短時間內揭示漫長的污染馴化過程難度很高;另一方面受傳統微生物分析方法的限制.因此,本文以遼東灣雙臺子河河口濕地為對象,針對該地區油井密布的實際情況,以石油污染物為主要污染物,采用濕地模擬實驗裝置,通過常規監測和PCR-DGGE技術分析微生物群落長期暴露于污染物中時逐漸演替、更疊的真實情況,為開發其中的微生物資源和保護河口濕地提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 濕地模擬及實驗用水

針對雙臺子河河口濕地進水的實際情況,結合濕地土壤及濕地植物根系的生長狀況,利用PVC及有機玻璃等材料研制6組帶配水裝置(以滿足模擬濕地進水的可控性)的濕地模擬試驗成套裝置,將高約 50cm 的雙臺河河口濕地土壤及濕地植物原位移入濕地模擬裝置.

表1 采樣條件及實驗用水情況Table 1 Characterization of river water for drip-irrigation and diesel oils addition

根據蘆葦濕地實際進水調查結果,蘆葦濕地主要進水分別為每年的5月初和6月底,其余時間均為適量補水.因此,分別于 2011年 5月和 6月采集主要進水河流和引水泵站的水樣,測定的石油類污染物濃度為 0.27～1.3mg/L.提水站水樣中石油類污染物的濃度明顯高于河流中的,說明柴油提水泵的使用增加了水中石油類的濃度,由于蘆葦濕地用水主要依賴提水泵站的供應,因此本研究實驗用水用柴油與河水進行配水,且實驗期間保持進水中石油類污染物濃度為1.3 mg/L.具體實驗期實驗用油量及環境條件如表1所示.

1.2 樣品采集與處理

采用抖根法分別取對照組和實驗組-10,-20,-30,-40cm 處蘆葦根際土壤樣品,用無菌封口袋裝好帶回實驗室,土壤首先通過孔徑 2mm 篩,去除較大植物組織與石塊,然后在冰上手工剔除肉眼可見的細根.土樣分成3份,第1份保存在4℃用于土壤環境參數和種群數量計數,第 2份保存在-20℃用于變性梯度凝膠電泳(DGGE )研究,第3份低溫避光條件下自然風干,粉碎研磨后過100目篩,用于正構烷烴和多環芳烴分析.所有樣品處理在取樣后6h內完成.

1.3 正構烷烴和多環芳烴的測定

稱 10.0g土壤樣品,加入少量無水硫酸鈉后用濾紙包好放入索氏抽提器中,瓶底放2.0g銅片去除硫的干擾,加入回收率指示物.150mL正己烷/二氯甲烷(V:V/1:1)索氏提取 24h(水浴鍋溫度80℃).將提取液旋轉蒸發濃縮至 5mL,加入 5mL正己烷再次旋轉蒸發濃縮至 5mL.濃縮液過氧化鋁(3cm)、硅膠(6cm)和無水硫酸鈉(0.5 cm)層析柱,分別用正己烷、二氯甲烷/正己烷(V:V/3:7)混合液洗脫樣品得到正構烷烴、多環芳烴.最后將淋洗液旋轉蒸發至1mL轉移至2mL棕色進樣瓶中,用柔和的氮氣吹至近干,然后用正己烷定容至1mL,待上機測定.

采用Agilent氣相色譜-質譜聯用儀HP6890 GC-HP5975MSD對樣品中的烷烴和多環芳烴進行分析.對樣品的定性分析主要依據其特征離子和色譜保留時間,同時與標準物質的質譜圖和質譜庫內標準質譜圖進行對照.烷烴和多環芳烴定量采用外標法.

1.4 土壤微生物種群數量測定方法

細菌、放線菌、真菌數量采用稀釋平板法計數,其所用培養基分別為:細菌－牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏 3.0g,蛋白胨 10.0g,NaCl 5.0g,瓊脂18.0g蒸餾水 1000mL,pH7.4～7.6);放線菌－高氏一號培養基(可溶性淀粉20.0g, NaCl 0.5g, KNO31.0g,H2O 0.5g, M0.5g,7H2O 0.01g,瓊脂 18.0g,水 1000mL, pH7.4～7.6);真菌－鏈霉素-馬丁孟加拉紅培養基(蛋白胨 5g,葡萄糖 10.0g, KH2PO41.0g, MgSO4·7H2O 0.5g,瓊脂 18.0g,1/3000孟加拉紅溶液 100mL,蒸餾水1000mL,鏈霉素0.03g,pH 7.4～7.6).

石油降解菌數量測定采用最大或然數(MPN)法測定[17-18],所用的培養基為改良的 Bushnel-Haas 培 養 基 (MgSO4·7H2O 0.2g,CaCl20.02g,KH2PO41.0g,(NH4)2HPO4,1.0g KNO31.0g,FeCl30.05g,柴油1.0mL,蒸餾水1000mL,pH7.6～7.8).

1.5 土壤微生物群落結構分析

1.5.1 DNA的提取 所有土壤樣品DNA的提取均采用PowerSoil DNA Isolation Kit (MOBIO Laboratories)試劑盒,稱取0.25g土壤樣品,按試劑盒提供的操作步驟進行土壤微生物總DNA提取.在1%瓊脂糖(1×TAE緩沖液)凝膠(內含5%的EB染料)中對提取的DNA進行檢測.

1.5.2 PCR 擴增 所用引物為細菌 16S rDNA V3區通用引物,F341和BA534-GC[19].擴增反應體系為 40μL 體系:包括 10×PCR buffer 4μL;dNTP(2.5mmol/μL) 3.2μL;每種引物 1.2μL;模板2μL;Taq DNA聚合酶0.4μL;加ddH2O至終體積40μL.反應程序為:預變性 94℃ 5min 30 個循環包括 94℃變性 40s,50℃退火 30s,72℃延伸 90s,最后 72℃延伸 10min.PCR完成后取反應產物5μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并與定量Maker DL 2000進行對比.

1.5.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析 采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統對PCR產物進DGGE分析[20].制備8%的丙烯酰胺溶液(丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為37.5:1),使用梯度混合裝置,制備 8%聚丙烯酰胺梯度凝膠,變性劑尿素和甲酞胺的濃度從 30%到60%,變性劑濃度從膠的上方到下方遞增.促凝膠催化劑TEMED和過硫酸氨(APS)的終濃度分別為 0.09%(V/V)和 0.05%(V/V).將凝固后的膠板放入加有 l×TAE緩沖液的電泳槽中,取 PCR產物20μL 和 4μL 6×Loading Buffer混合后加入上樣孔中,60℃,150V 電泳 9h.電泳結束后,將凝膠用EB (l:1000的稀釋液)進行染色 30min,然后去離子水浸洗 2min.染色之后,在紫外凝膠成像系統下觀察凝膠的條帶,并拍攝圖像.

1.5.4 DGGE條帶的切割、克隆與測序 切割亮度較明顯的條帶,編號放入1.5mL滅菌的離心管中,并加入20μL滅菌水磨碎,用引物F341和BA534R重新進行PCR擴增產生長度為200bp的片段,其他步驟同上述 PCR擴增.電泳切取亮帶放入收集管中待純化.產物純化按spin膠純化試劑盒說明書進行.將已純化的 PCR產物連接到載體 PMD19-T Vector上,導入DH5α感受態細胞, 加入LB液體培養基培養.以M13為引物進行菌落PCR,檢測產物是否為陽性.測序由南京金斯瑞公司執行.

1.6 數據處理與統計

實驗數據統計及相關性分析采用SPSS 19.0.測序后其結果在GenBank數據庫中用BLAST進行檢索并進行同源性比較.15條優勢帶的基因片段序列與GenBank中細菌序列相似性分析,其測序結果可以確定出各條帶所代表的菌群分類地位.應用QuantityOne軟件對DGGE圖譜中的條帶數目和亮度進行分析.

2 結果與討論

2.1 正構烷烴和多環芳烴在蘆葦根際的分布

蘆葦根區土壤中正構烷烴各組分的濃度及分布情況見圖 1.濕地蘆葦根區土壤中定量檢出的正構烷烴系列主要集中在C10～C33之間.含油河水灌溉的實驗組蘆葦根區土壤正構烷烴的分布與對照組明顯不同,實驗組濃度較高且主要集中在C13～C26之間,其中C20左右的濃度最高,達到了 3.33μg/g.而對照組各碳數的分布較為平均且濃度均較低,最高值僅為 0.052μg/g,近于實驗組的百分之一.從蘆葦整個生長期來看,實驗組各月份正構烷烴的分布特征較為相似,均為單峰型分布,顯示了石油烴的輸入特征[21].從縱向看,對照組-10cm 處正構烷烴總濃度(∑n-alkanes)為0.313～0.395μg/g,-40cm 處∑n-alkanes 濃度為0.233～0.292μg/g,在縱向上基本符合-10cm>-20cm>-30cm>-40cm,但隨土層深度的變化幅度較小,分布較為均勻;實驗組-10cm 處∑n-alkanes濃度在 23.69～34.84μg/g之間,且隨深度變化較大,-40cm 處∑n-alkanes濃度為 1.19～2.38μg/g,僅為-10cm的 1/20,說明添加的正構烷烴主要集中于濕地土壤的表層.

圖1 濕地植物根區土壤正構烷烴各組分的濃度及分布Fig.1 Distributions of n-alkanes in reed rhizosphere soils drip-irrigated with/without river water added diesel oils

蘆葦根區土壤中多環芳烴(PAHs)各組分的濃度及分布見圖2.實驗組和對照組蘆葦根區土壤中均檢測出 14種 PAHs,對照組中高分子量(4～6環)、難生物降解的PAHs占∑PAHs的近50%,且分布在蘆葦整個生長季內無明顯變化,土著微生物對PAHs的降解能力較弱.實驗組PAHs各組分分布與對照組相似,其中萘、芴、菲、芘占∑PAHs比重較高,約為 37.0～74.3%.濃度最高的主要集中于-10cm 土層中,隨著深度的增加迅速減小.實驗組∑PAHs濃度在-10cm處的平均值為963.25ng/g約為-40cm處平均值385.89ng/g的2.5倍.

圖2 濕地植物根區土壤多環芳烴各組分的濃度及分布Fig.2 Distributions of PAHs in reed rhizosphere soils drip-irrigated with/without river water added diesel oils

2.2 石油污染對蘆葦根際微生物數量的影響

細菌、放線菌和真菌是土壤微生物群落的3種重要組成部分,對有機物的礦化起著重要作用.實驗初期蘆葦根際的這 3種微生物群落數量明顯受到石油污染物連續輸入的影響(表 2).石油污染物的輸入減少蘆葦根際細菌、放線菌和真菌的數量,但增加了根際土壤的有機質和微量元素的含量,促進了石油烴降解菌的生長和繁殖[22-23].但經過 6個月灌溉后,除添加石油污染物的細菌數量約為未添加的1/4外,實驗組的放線菌和真菌的數量均與未添加的相近,說明經過長時間的石油輸入,放線菌和真菌已適應了石油污染的環境.石油烴降解菌的數量則增加了55～215倍.此外,皮爾森相關分析也表明蘆葦根際微生物種群數量與正構烷烴和多環芳烴的濃度有明顯關系(表 3),即污染物濃度越高,微生物種群數量越小.其中,細菌對石油最為敏感,根際土壤每一層的細菌數量均與氧化還原電位(ORP),正構烷烴和多環芳烴濃度呈顯著的負相關性.而放線菌和真菌只是在表層土壤受 ORP,正構烷烴和多環芳烴濃度的影響比較明顯.石油降解菌的數量與氧化還原電位,正構烷烴和多環芳烴的濃度呈顯著正相關性(R=0.886～0.978,P<0.01).含水量對蘆葦根際種群數量的影響并不明顯.

表2 灌溉期內蘆葦根區微生物種群數量變化Table 2 Microbial abundance of reed rhizosphere soils drip-irrigated with/without river water added diesel oils in six-month irrigation process

表3 微生物種群數量與土壤參數及有機質相關性分析Table 3 Coefficients of Pearson’s correlations between microbial abundances and the soil parameters and organic matters

2.3 石油污染對蘆葦根際細菌群落結構的影響

對含油河水灌溉組和對照組各月份-10cm土壤樣品進行 DGGE分析,各土壤樣品的變性梯度凝膠電泳(DGGE)譜圖如 3(a)所示.由指紋圖譜可以看出,S1～S12各樣品的條帶數目,位置和亮度均存在一定的差異性.S1～S6樣品中條帶2均有出現且較亮,而在S7～S12中并不明顯,說明條帶2是石油污染影響下的優勢種群.S4樣品中出現了有異于其他樣品的條帶,且條帶數目較多,說明經過長時間的石油輸入,微生物適應了石油污染的環境,以烴類作為碳源和能源的石油降解菌菌群數量增加[24-25],與 9月份石油降解菌菌群數量最高相符.其中條帶1在S1出現后,在S3和S4都均存在,說明該菌群為能降解石油的菌群.S7～S12樣品條帶數目較 S1～S6多,表明石油污染一定程度上降低了土壤微生物群落多樣性.細菌圖譜的聚類分析結果如圖3(b)所示,群落結構最為相似的是S10和S11,其中S6和S9,S7和S8,S1和S3的群落結構分別較相似,S1～S5與S6～S12最后聚在一起,相似性差異較大,進一步說明石油污染對土壤細菌群落結構產生了影響.根據蘆葦根際微生物群落DGGE圖譜中出現的優勢和特殊條帶進行割膠回收測序,測序后其結果在 GenBank數據庫中用BLAST進行檢索并進行同源性比較.15條優勢帶的基因片段序列與 GenBank中細菌序列相似性如表 4.結果顯示,經過 6個月的含油河水灌溉后,形成了以變形菌門(Proteobacteriumspp.)和擬桿菌門(Bacteroidetesspp.)為主要優勢菌的群落結構,而厚壁菌門(Firmicutesspp.),放線菌門(Actinobacteriaspp.)和藍藻門(Cyanobacteriaspp.)則受到不同程度的抑制.

圖3 蘆葦濕地-10cm深度土壤細菌群落的DGGE分離圖譜及聚類分析樹狀圖譜Fig.3 DGGE profiles of microbial communities of reed rhizosphere soils (-10cm depth) and cluster analysis

表4 測序比對結果Table 4 Sequence similarities to closest relatives and phylogenetic affiliations of DNA recovered from DGGE gel

3 結論

3.1 濕地植物根區主要檢測到 C10～33的正構烷烴,含油組正構烷烴均為單峰型分布且波峰主要集中在 C13～C26,奇偶優勢不明顯且主峰碳數較低,顯示了石油烴的輸入特征;而未添加柴油對照組各碳數的分布較為平均且濃度均較低,最高值僅為0.052μg/g.說明微生物降解尤其針對低碳數的作用明顯.

3.2 含油河水灌溉的總多環芳烴(∑PAHs)含量是未添加柴油對照組的近10倍,萘、芴、菲、芘在 16種多環芳烴中所占的比重較大.多環芳烴(PAHs)的分布特征除濃度增加外變化不明顯,說明濕地植物根區的多環芳烴也來源于石油污染,且土著微生物對PAHs的降解能力較弱.

3.3 石油污染物的輸入減少蘆葦根際細菌的數量,但促進了石油烴降解菌的生長和繁殖.經過 6個月的含油河水灌溉后,添加石油污染物的細菌的數量約為未添加的 1/4.而石油烴降解菌的數量則增加了55～215倍.皮爾森相關分析也表明蘆葦根際細菌數量與根區土壤中的 ORP,正構烷烴和多環芳烴的濃度有明顯關系.

3.4 運用PCR-DGGE技術對細菌群落結構進行分析時也發現石油污染物質連續輸入的初期階段降低了微生物的數量,但經過 6個月的自我調節,微生物數量在連續輸入的末期逐漸又恢復到初期的程度,但微生物群落結構發生了變化,形成了以變形菌門(Proteobacteriumspp.)和擬桿菌門(Bacteroidetesspp.)為主要優勢菌群的群落結構.

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