基于T-RFLP和因子分析的香蒲根際細菌群落研究

馬棟山,熊 薇,張瓊瓊,郭羿宏,趙文吉,郭逍宇* (1.首都師范大學資源環境與旅游學院,北京100048；2.北京市城市環境過程與數字模擬重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地,北京 100048)

T-RFLP分析較DGGE、SSCP或ARDRA等方法具有分析精細、分析能力強、易于自動化等優勢,另外通過ABI自動測序儀對任何一末端限制性片段的測序結果均可與 Internet數據庫(http://www.cme.msu.edu)的數據進行比較分析[1].已有學者成功應用T-RFLP技術進行菌種的鑒定、濕地、農田、水體等多生態環境中微生物群落多樣性及其動態變化研究[2].但對環境樣品進行T-RFLP分析時,可產生大量的酶切片段,其中 80%～90%的酶切片段(T-RFs)屬于非培養片段或數據庫信息不全而無法比對到種屬特征,因而無法對該片段進行深入分析.多元統計特征分析因其在海量數據中挖掘數據的內在規律方面有較大的優勢,因而得到了人們的重視.已有學者初步嘗試借用統計學方法對T-RFLP分析中酶切片段進行分析[3].

再生水作為北京市穩定的第二新型水源,在維持河湖景觀、恢復河湖生態等方面發揮了重要作用,而再生水水質特性決定了其城市河湖景觀補水存在多種負面生態環境效應[4].以氨氮為河道水體富營養化主控因素的再生水補水河湖濕地水污染防治成為濕地研究的熱點問題之一[5].人工濕地具有低投資、低能耗、低處理成本和脫氮除磷功能,是目前再生水廠河湖景觀補水之前普遍采用的水質凈化方式.濕地再生水處理機理不僅體現在植物通過吸收作用去除氮、磷等污染物,更體現在植物通過根際分泌物影響系統中微生物特性進而影響系統處理效果[6].濕地植物根際微生物群落結構與功能隨濕地植物種類、季節及濕地類型等因素的變化而變化[7],濕地補水水源水質的好壞同樣影響植物根際微生物功能和生物過程[8].大量文獻分析了氨氧化細菌在水體、底泥、農田等諸多環境中群落結構及其多樣性特性[9-10].但對水生植物根際氨氧化細菌群落組成及多樣性的研究尚不多見.基于此本文擬借助于因子分析(FA)、去除勢典范對應分析(CCA)等多元統計分析方法,結合T-RFLP技術產生的大量T-RFs片段構建的多樣性指數和PAT比對結果等常規分析方法對王平濕地再生水補水口、遠離補水口香蒲根際細菌和氨氧化細菌群落多樣性及其結構特征進行對比研究,為再生水補水濕地植物根際微生物群落凈化機理提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 研究區概況

王平濕地(39°58.580′E,115°58.930′N)西起王平溝口,東至南澗溝口,全長 1050m,屬門頭溝永定河段.王平濕地系統內水生植物主要包括香蒲、蘆葦、浮萍等,其中,香蒲的覆蓋度可達70%～90%.采樣點位于門頭溝王平村左岸附近.再生水主要來源于王坪村電廠和周邊的居民生活區,再生水排放量約為0.9萬t/a.

1.2 樣品采集及理化指標分析

圖1 北京市王平濕地采樣點分布示意Fig.1 Distribution of sampling sites in Wangping Wetland in Beijing

選取王平濕地不同處理區植物香蒲為研究對象,分別取河流濕地再生水補水口的上游點位L1(補水口上游 200m),再生水補水口 L2以及補水口下游300m處的L3;人工濕地再生水補水口位點 L4(距離 L2位點 1000m)(圖 1).采樣時間2012年9月,去除植物根系上的動植物殘骸及石塊等非底質雜物,收集附著在根系上的底泥作為樣本.每個點位設5個平行.采集的樣品裝在干凈密封的聚四氟乙烯塑料袋中,

于 4℃下保存并及時送回實驗室,每個位點的 5個平行樣等量混合后最終成為一個樣點,共計四個樣點,分別記為 L1、L2、L3、L4[11].樣品分兩部分處理:一部分進行理化指標分析,總氮(TN)采用凱氏定氮法,總磷(TP)采用堿熔—鉬銻抗分光光度法,總有機碳(TOC)采用重鉻酸鉀氧化—分光光度法測定,銨態氮采用2mol/L KCl浸提—靛酚藍比色法測,氧化還原電位采用ORP儀直接測量,重金屬采用原子吸收光譜法,具體測定結果見表 1.剩余根際土壤樣品于-20℃下保存,用于微生物群落結構分析.

1.3 基于T-RFLP的微生物群落結構分析

1.3.1 DNA提取 采用土壤樣品提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取根際樣品總DNA,操作步驟按照使用說明書進行.提取總DNA經 0.8%(m/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定,提取的DNA放置于-20℃條件下保存備用.

1.3.2 PCR擴增 PCR技術采用史青應用T-RFLP 技術分析滇池污染水體的細菌群落技術[12]進行擴增.

表1 不同樣點香蒲根際土壤的理化性質Table 1 Physical and chemical properties of cattail rhizospheric soil in different plots

1.3.3 末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)分析 分別采用MspⅠ、HhaⅠ、HaeⅢ對熒光PCR產物進行酶切.在 37℃下放置 3～5h.然后在 65℃條件下溫浴15min使酶失活.隨后將酶切產物送至天根生物技術有限公司進行基因掃描(GeneScan),得到T-RFLP圖譜.

1.3.4 氨氧化細菌克隆文庫的建立和測序 采用王亞男等[13]的直接法克隆和測序分析,取總DNA,進行PCR擴增、克隆、測序.

1.4 數據處理與分析

用Peak Scanner進行分析.舍去小于50bp和大于500bp的片段.對于細菌,由于相對數量過小的限制性末端片段(T-RFs)不會對群落的特性產生明顯的影響[14-16],故在本分析中舍去了相對數量<1%的 T-RFs,然后分別計算圖譜中每一個峰的峰面積與所有峰總面積的比值,將每個 T-RF所占的百分比作為權重導入Primer軟件,聚類方法選擇組間平均距離法,距離選擇平方歐氏距離,做出聚類分析圖.綜合采用 Peak Scanner、CanoDraw for Windows、primer和 Excel2007 軟件對數據進行分析,得出聚類圖、優勢菌種、多樣性指數以及CCA排序.

2 結果與討論

2.1 基于T-RFLP譜圖的聚類分析

把采集樣品基于 T-RFLP微生物群落結構分析的譜圖進行預處理之后,采用Primer分析結果如圖2(a)所示.以相似性50%為標準,可以將細菌各樣點分為三類:細菌類群 BⅠ由位于再生水補水口上游位置的L1樣點組成,類群BⅡ由再生水補水口L2與L4樣點組成,類群BⅢ是位于再生水補水口下游位置L3樣點構成;如圖2(b)所示,以相似性 32%為標準,可以將氨氧化細菌各樣點分為兩類:氨氧化細菌類群AOBⅠ包含遠離再生水補水口L1和L3樣點;氨氧化細菌類群AOBⅡ則包含再生水補水口L2和L4兩樣點.

從聚類結果可知,細菌類群以受再生水干擾程度的強弱而進行分群并類,不同濕地類型 L2與L4因受再生水補水口水質影響同樣歸并為一類.與氨氧化細菌群落的分類結果相比,細菌群落對環境條件的變化較氨氧化細菌群落結構更為敏感,可能與氨氧化細菌群落主要由環境條件中不同形態氮素濃度梯度決定,細菌群落變異可能是環境條件變異的綜合反應[17].

圖2 各樣點細菌群落和氨氧化細菌的等級聚類分析Fig.2 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of the bacterial and AOB from different sampling plots

2.2 再生水補水對不同樣點細菌和 AOB群落結構多樣性的影響

酶切圖譜和多樣性指數結果均顯示,MspI酶切樣品微生物多樣性略高于HhaⅠ、HaeⅢ酶切,故后續分析采用MspI酶切結果[18].以MspⅠ為酶切的不同類群香蒲根際細菌和AOB群落多樣性指數見表 2.細菌各類群多樣性指數均隨再生水干擾強度的增加依次表現 BⅠ>BⅢ>BⅡ的變化趨勢,而氨氧化細菌群落則與細菌群落呈現相反的變化趨勢,即再生水補水口氨氧化細菌各群落多樣性指數均明顯高于遠離補水口氨氧化細菌群落.再生水補水不僅降低了細菌群落結構中物種的豐富度,同時為應對再生水中豐富氮磷等水質特性,細菌群落結構中與再生水水質特性密切聯系的優勢類群在群落結構中占有主導優勢,群落均勻度降低,進而群落綜合多樣性指數降低.對于 AOB而言,再生水中高濃度氮含量是導致再生水補水口氨氧化細菌群落各多樣性指數顯著升高的直接原因[20].

2.3 再生水補水對不同樣點細菌和 AOB群落結構的影響

以MspⅠ酶切結果計算各類群中 T-RFs片段的豐度,T-RFs片段豐度值>4%的類型為優勢菌群[20],而片段豐度值<1%的類型為偶見菌群,其余為非優勢菌群[21],以MspⅠ為酶切的香蒲根際細菌和AOB群落結構的空間差異見表3.隨再生水干擾強度增強細菌類群 T-RFs片段數呈明顯降低趨勢;細菌類群 BⅠ因其較高豐度的非優勢菌群和偶見菌群,從而群落均勻度較高,而細菌類群 BⅡ則因較低豐度的非優勢菌群及不具偶見菌群從而群落均勻度較低;遠離再生水補水口氨氧化細菌群落AOBⅠ較補水口AOBⅡ具較少的T-RFs片段數,且其優勢氨氧化菌群相對豐度值遠高于AOBⅡ,表明在再生水作用下氨氧化細菌優勢片段數量的增加、非優勢片段數量的減少和偶見片段數量的消失是導致 AOBⅠ群落豐富度和均勻度降低的主要原因.

表2 以MspⅠ為酶切的不同類群香蒲根際細菌和氨氧化細菌群落多樣性指數Table 2 Diversity indexes of cattail rhizospheric soils bacterial and AOB community in different groups with Msp I enzyme

2.4 基于傳統T-RFs片段與多元統計相結合分析

2.4.1 MiCA 比對結果 將HaeⅢ、MspⅠ、Hha3Ⅰ種內切酶消化的T-RFLP圖譜屬性數據上傳到 Phylogenetic Assignment Tool(PAT,https://secure.limnology.wisc.edu/trflp/newuser.jsp)網站[22-23],并結合 MiCA (http:// MiC A.ibest.uidaho.edu/pat.php通過 Virtual Digest(ISPaR)模塊產生的基礎數據庫對起主要作用T-RFs類型的系統發育分類進行推測.之后通過計算其細菌 T-RFs比例,以占據整個 T-RFs的4%以上為優勢菌種;而 AOB通過電子酶切(MspⅠ、HhaI、Hae)Ⅲ得出的片段和克隆得出的片段相比對,比對可能種屬見表4.

表3 MspⅠ酶切細菌和氨氧化細菌群落結構空間差異Table 3 The spatial differences of cattail rhizospheric soils bacterial and AOB community structures with Msp I enzyme

表4 MspI酶切香蒲根際細菌和AOB類群可能種屬Table 4 The corresponding species and features of cattail rhizospheric soils bacterial and AOB communities with Msp I enzyme

2.4.2 因子分析 以基于細菌和氨氧化細菌群落MspⅠ酶切,結果顯示細菌群落篩選出的73個T-RFs片段反應的信息累計方差達到 92.3%,而氨氧化細菌群落篩選出的56個T-RFs片段反應的信息累計方差達到 95.4%,表明兩個原始數據矩陣均可以較好地反應基于片段的源解析[24],統計結果見表5.細菌群落因子分析將73個T-RFs片段降為三個維度,其中 PCA1提取了 33個T-RFs片段,除81bp片段之外,其余32個非培養或數據庫中無匹配.根據因子分析原理可比對的81bp片段可能與不可比對的32個T-RFs片段具有共同或相近的源,即81bp片段可能與不可比對的32個T-RFs片段共同受水質生境特征中某一相同環境因子的制約和影響,或與水質生境特征中某一環境因子的生物化學循環過程具有密切的關系.同樣 PCA2和 PCA3中提取27個和11個非培養或數據庫中無匹配的 T-RFs片段可能與其對應維度中可比對的150bp和138bp片段具有共同或相近的源.基于氨氧化細菌群落的因子分析將56個T-RFs片段降為兩個維度,對于氨氧化細菌群落中PCA4中提取的39個T-RFs片段可能與Nitrosospirasp.具有共同或相近的源,而PCA5代表的 17個 T-RFs片段可能與是Nitrosomonassp.共同或相近的源.

2.4.3 典范對應分析 為驗證基于MiCA比對結合因子分析結果見圖3.排序結果表明CCA排序圖第一軸AX1和第二軸AX2的特征值累計占總特征值的 71.23%,排序圖包含了大部分的信息,排序效果良好.對于細菌群落而言,再生水補水口樣點2和樣點4在排序圖中具有共同的分布格局與范圍,同時與樣點2和樣點4具共同分布格局的T-RFs片段主要包括了以150bp為代表的PCA2中所有T-RFs片段,這些片段占到樣點2和樣點4所代表的BⅡ群落總豐度的55.6%.環境因子中TOC與樣點2和樣點4具有共同分布格局與范圍的結果則進一步證明再生水補水口以 150bp為代表的占群落總豐度55.6%菌群均與水中TOC的生物化學循環過程具有密切關系. 而且過比對發現 150bp片段對應的種屬為鞘氨醇單胞菌屬,Onruthai研究表明鞘氨醇單胞菌是環境中比較獨特的一類降解菌,它們的降解范圍非常寬,從單環、多環芳烴到其它有機污染物都可以作為它們生長的碳源[25].PCA2是通過聚類而得,表明在PCA2類群當中,除去不能確定的非培養的細菌類群外,很有可能其余的片段大部分與碳循環是相關的.

表5 以MspI為酶切的香蒲根際細菌和AOB類群的PCA聚類片段和比例Fig.5 Clustering fragments and proportion of cattail rhizospheric soils bacterial and AOB communities with Msp I enzyme

左圖:細菌a:61,68,80,81,86,88,89,91,111,120,141,143,144,157,159,160,167,187,193,205,261,274,276,277,473,492,494,497 b:76,85,87,92,124,128,135,145,155,162,165,175,183,204,286,425,451,466,467,469,485,486,487,488,496右圖:AOB a:70,71,78,85,86,92,192,193,195,205,232,259,263,492 b:52,57,63,69,74,83,104,119,142,151,160,174,219,225,234,237,264,265, 491

圖3 以MspI為酶切的香蒲根際細菌和氨氧化細菌樣方、物種與環境因子的典范對應分析(CCA)Fig.3 Canonical correspondence analysis biplot of the cattail rhizospheric soils bacterial and AOB communities in relation to the species and environmental factors

再生水補水口上游樣點 1在排序圖中的T-RFs片段主要包括了以81bp為代表的PCA1中所有bp片段,它們的相對豐度和占到整個BⅡ群落總豐度的 75.5%.環境因子中 TN、TP和銨態氮與樣點 1具有共同分布格局的結果則進一步證明再生水補水口上游以81bp為代表的菌群與水質生境特征中TN、TP和銨態氮的生物化學循環過程具有密切關系. 經過比對發現 81bp對應的是假單胞菌屬和Geitlerinemasp.屬.假單胞菌屬是一種在有機污染中普遍存在的菌屬,可以利用包括單碳在內的許多有機物作為自身的能量和碳源,以有機氮或無機氮為氮源進行化能營養生活[26],而Geitlerinemasp.是專性屬于底棲生物環境,與水環境中氮的循環具有密切關系已得到普遍的認同[27],這與 CCA分析的結果中與環境因子氮循環具有密切關系的結果保持一致.再生水補水口下游樣點3在排序圖中的T-RFs片段主要包括了以 138bp為代表的 PCA3中所有bp片段數,它們的相對豐度和到整個BⅢ群落總豐度的68.7%.環境因子重金屬Cu、V和Ti與樣點 3具有共同分布格局與范圍的結果則進一步證明再生水補水口以 138bp為代表的相似菌群均與水質生境特征重金屬Cu、V和Ti具有密切關系.

對于AOB而言,與樣點2和樣點4具共同分布格局的T-RFs片段主要包括了以266bp為代表的PCA5中所有T-RFs片段,這些片段占到樣點 2和樣點 4所代表的 AOBⅡ群落總豐度的65.5%.環境因子中NH3-N與樣點2和樣點4具有共同分布格局的結果進一步證明再生水補水口以 266bp代表的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonassp.)受到再生水銨態氮的影響較大.以58bp為代表的PCA4中所有T-RFs片段,這些片段占到樣點1和樣點3所代表的AOBⅠ群落總豐度的97.6%.環境因子中TOC與樣點1和樣點 3具有共同分布格局與范圍的結果則進一步證明再生水補水口以58bp為代表的亞硝化螺菌屬菌(Nitrosospirasp.)受到銨態氮的影響較小.AOBⅡ中包含兩個再生水補水口的銨態氮的含量遠遠大于AOB,Ⅰ AOBⅡ中數量豐度最多的亞硝化單胞菌屬是在富含氨氮環境中具有競爭優勢,而偏好相對低氨環境的亞硝化螺菌屬則數量極少.

3 結論

3.1 細菌類群以受再生水干擾程度的強弱而進行分群并類,不同濕地類型因受再生水補水口水質影響歸并為一類.

3.2 再生水補水口細菌群落以有機碳循環為主,補水口上游主要以氮循環為主,遠離補水口細菌類群主要體現重金屬的生物化學循環.

3.3 266bp為代表的Nitrosomonassp.具相似功能的菌群適合在高氨環境中生長;58bp所代表的

Nitrosospirasp.具相似功能特性的菌群適合在相對低氨環境中生長.

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