墨西哥柏幼苗耐寒性研究

蔡祺　萬福緒　韓李荃

摘要[目的]研究不同墨西哥柏幼苗在不同低溫環境下各生理指標的變化。[方法]以10個不同種源的墨西哥柏離體葉片為材料進行低溫脅迫試驗，研究低溫脅迫對墨西哥柏可溶性糖含量、可溶性淀粉含量、可溶性蛋白含量、過氧化物酶活性的影響。[結果]墨西哥柏可溶性糖含量呈現一直上升的變化趨勢，可溶性糖含量的增加有利于提高苗木的抗寒性；可溶性淀粉含量呈現“低-高-低”的變化趨勢，可溶性淀粉含量的減少有利于提高苗木的抗寒性；可溶性蛋白含量呈現“低-高-低”的趨勢，可溶性蛋白含量的增加有利于提高苗木的抗寒性；過氧化物酶活性大多呈現“低-高-低”的趨勢，過氧化物酶活性的增加有利于提高苗木的抗寒性。[結論]不同低溫處理下，墨西哥柏幼苗可溶性糖含量、可溶性淀粉含量、可溶性蛋白含量、過氧化物酶活性差異極顯著。

關鍵詞墨西哥柏；低溫脅迫；生理指標；耐寒性

中圖分類號S791文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）09-02651-04

基金項目國家“948”課題（2009417）。

作者簡介蔡祺（1988-），男，內蒙古錫林浩特人，碩士研究生，研究方向： 林業生態工程。*通訊作者，教授，博士生導師，從事林業生態工程、水土保持研究。

墨西哥柏（Cupressus lustanica Mill），又名露絲柏，系柏木科柏木屬常綠高大喬木。墨西哥柏原產中美洲的墨西哥高原及危地馬拉南部地區，15°～27° N，垂直分布在海拔1 300～3 300 m。墨西哥柏大多生長在山坡及氣候溫暖濕潤的河谷旁。原產地氣候溫暖濕潤，屬于亞熱帶溫和至溫暖氣候；年平均氣溫10～17 ℃，每年干旱時間為2～3個月，全年降雨分布為均勻雨型，全年降雨量在1 000～1 500 mm，冬季有少量雨雪[1-3]。墨西哥柏是近年來石漠化治理的主要樹種之一，該研究對墨西哥柏幼苗的耐寒性進行了分析，以期為篩選耐寒種苗提供基礎資料。

1材料與方法

1.1試驗材料2010年，從墨西哥（La presa、Pinal deamoles、La cienega、La cumbre del manzano、Dos aguas、Camino a la mesa、Ejido pio frio、Comunal san francisco、Tequesquinahuac、Ejido sierra de agua）成功引進10種不同地理種源墨西哥柏種子，種源依順序分別用D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9、D10表示（表1）。

1.2試驗處理試驗材料為10種墨西哥柏2年生幼苗。每種源隨機選取3棵樹，3次重復。每次采樣取生長健壯、長勢整齊均勻的植株，剪取1 cm長的枝條。將供試苗木先用自來水沖洗，再用去離子水反復沖洗干凈，用濾紙吸干苗木外表水分。將每個材料葉片分成4份，放入密封的塑料袋內。將分裝好的葉片放入預設好溫度的冰箱內，溫度梯度分別為0、-4、-8、-12 ℃。將需采取人工低溫處理的試驗材料先在2 ℃的冰箱內預冷2 h，然后模擬自然降溫過程，從0 ℃開始按照4 ℃/h的降溫速度逐步進行降溫。到達設定溫度后停留24 h，將材料取出后置于2 ℃冰箱中解凍2 h后再進行研究。

1.3指標測定方法測定每個溫度梯度下樣品的可溶性糖含量、可溶性淀粉含量、可溶性蛋白含量、過氧化物酶（POD）活性。可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[4]；可溶性淀粉含量測定采用蒽酮比色法[4]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250法[5]；POD活性測定采用愈創木酚比色法[6]。

2結果與分析

2.1低溫脅迫對10種墨西哥柏可溶性糖含量的影響試驗表明，在低溫脅迫下，隨著低溫脅迫傷害的不斷加深，10種墨西哥柏的葉片可溶性糖含量整體呈不同程度的上升趨勢，每個種源上升的幅度不同，個別種源隨溫度降低出現了先上升后下降的趨勢（圖1）。在0 ℃脅迫下，墨西哥柏可溶性糖含量最低，其中D2種源含量最低為15.272 mg/g，D4、D5、D6、D9、D10種源的可溶性糖含量較高，D4種源可溶性糖含量是D2種源的1.2倍。0～-4 ℃各種源葉片可溶性糖含量有小幅度的上升，D5種源在-4 ℃時可溶性糖含量達到20287 mg/g，是D8種源的1.26倍，D9種源增長的最少。-4～-8 ℃，墨西哥柏葉片可溶性糖含量上升幅度加大，說明植物已經逐漸適應低溫環境，對寒冷產生了抵御。相對于0 ℃時的可溶性糖含量，D5種源漲幅最大，約為0 ℃時的1.35倍。在-8～-12 ℃，墨西哥柏可溶性糖含量增長減緩，D5種源葉片可溶性糖含量出現小幅回落。方差分析結果表明，Sig=0.000<0.01，說明不同溫度處理間可溶性糖含量差異極顯著；Sig=0.000<0.01，說明種源間的可溶性糖含量差異極顯著；Sig=0.075>0.05，說明各種源與溫度交互下墨西哥柏葉片可溶性糖含量差異不顯著。各種源墨西哥柏葉片的可溶性糖含量在不同低溫脅迫下平均值大小順序為：-12 ℃、-8 ℃、-4 ℃、0 ℃。D9種源葉片可溶性糖含量最大，D8種源最小。

2.2低溫脅迫對10種墨西哥柏可溶性淀粉含量的影響試驗表明，10種不同種源地的墨西哥柏的可溶性淀粉含量隨溫度的降低，大多表現為先下降再上升再下降的趨勢，個別種源呈現出下降再上升或者一直下降趨勢，但各種源在不同溫度脅迫下，下降或者上升的幅度并不相同（圖2）。在0 ℃時，不同種源葉片可溶性淀粉的含量有所差別，其中D5、D6和D7種源的葉片可溶性淀粉含量較高，D3、D8和D9種源含量較低，含量最高的D7種源是含量最低的D3種源的2.4倍。在0～-4 ℃，各種源葉片的可溶性淀粉含量快速下降，且降幅較大，其中D6種源下降最快，降幅最大，達到179%，D7、D8、D9種源下降幅度與其他種源相比較小，在-4 ℃時，D3種源葉片可溶性淀粉含量最少，約為4.491 mg/g。在-4～-8 ℃，部分種源葉片可溶性淀粉含量有小幅度的上升，D2、D3種源葉片可溶性淀粉上升幅度較大，而D1、D6、D7和D8種源的可溶性淀粉含量繼續下降，但下降幅度都不大，可能因為這些種源對低溫的反應速度與其他種源不同。在-8～-12 ℃，大部分種源葉片的可溶性淀粉含量繼續下降，但下降幅度都不大。方差分析結果表明，Sig=0.000<001，說明不同溫度處理間可溶性淀粉含量差異極顯著；Sig=0.056>0.05，說明種源間的可溶性淀粉含量差異不顯著；Sig=0018<0.05，說明各種源與溫度交互下墨西哥柏葉片可溶性淀粉含量差異顯著。各種源墨西哥柏葉片的可溶性淀粉含量在不同低溫脅迫下平均值大小順序為：0 ℃、-8 ℃、-12 ℃、-4 ℃。D5種源葉片可溶性淀粉含量最大，D10種源最小。

圖2低溫處理對10種墨西哥柏可溶性淀粉含量的影響2.3低溫脅迫對10種墨西哥柏可溶性蛋白含量的影響試驗表明，隨著人工低溫脅迫的加深，10種墨西哥柏葉片內可溶性蛋白隨溫度降低呈現“低-高-低”的趨勢，并在-8 ℃處達到峰值，在-8～-12 ℃之間迅速下降，降幅較大（圖3）。在0 ℃處，D1～D10這10種墨西哥柏葉片的可溶性蛋白的含量在1.016～1.443 mg/g之間，其中D5種源的可溶性蛋白含量最高，D10種源的可溶性蛋白含量最低。在0～-4 ℃間，不同種源墨西哥柏葉片的可溶性蛋白含量的漲幅都不大，其中D5和D7種源葉片的可溶性蛋白含量基本不變。在-4～-8 ℃處，不同種源的墨西哥柏葉片可溶性蛋白含量仍呈小幅度增長趨勢，D4種源增幅最小，只有9.9%。-8～-12 ℃，D1～D10 10種墨西哥柏葉片的可溶性蛋白含量快速下降，降幅分別為80.88%、53.66%、25.80%、6524%、19.76%、4052%、3370%、60.93%、80.48%和7736%。方差分析結果表明，Sig=0.000<0.01，說明不同溫度處理間可溶性蛋白含量差異極顯著；Sig=0.000<0.01，說明種源間的可溶性蛋白含量差異極顯著；Sig=0.071>005，說明各種源與溫度交互下墨西哥柏葉片可溶性蛋白含量差異不顯著。各種源墨西哥柏葉片的可溶性蛋白含量在不同低溫脅迫下平均值大小順序為：-8 ℃、-4 ℃、0 ℃、-12 ℃。D5種源葉片可溶性蛋白含量最大，D1種源最小。

2.4低溫脅迫對10種墨西哥柏過氧化物酶（POD）活性的影響試驗表明，10種墨西哥柏在低溫脅迫不斷加深的過程中，葉片的過氧化物酶活性整體呈現“低-高-低”的趨勢，并在-8 ℃處出現峰值（圖4）。在0～-4 ℃整體呈現出隨溫度的降低過氧化物酶活性增高，個別種源繼續降低，在-4～-8 ℃，各種源葉片過氧化物酶活性整體呈現出隨溫度的降低而增高的趨勢，在-8～-12 ℃呈現出隨溫度繼續降低各種源葉片過氧化物酶活性又急劇降低的變化規律。在0 ℃，D9種源葉片的過氧化物酶活性最低，約為93 U/（min·g），D2的過氧化物酶活性最高，約為214 U/（min·g）。0～-4 ℃間，各種源過氧化物酶活性大多呈上漲趨勢，D1、D2、D7和D10種源表現為不同程度的下降，其中D2、D7種源葉片過氧化物酶活性下降較快，下降幅度約為23.24%、59.02%，D1、D10變化幅度極小。在-4～-8 ℃，除D4、D9種源葉片過氧化物酶活性變化不大，其他種源葉片均增長幅度較大，特別是D1、D6和D8種源，其葉片過氧化物酶活性急劇增長，增幅分別約為126.61%、141.75%和94.72%。在-8～-12 ℃，各種源墨西哥柏葉片過氧化物酶活性急劇下降，其中D1、D2、D3、D6、D7和D8種源降幅較大，分別為106.19%、108.14%、137.63%、104.55%、112.68%和119.55%。方差分析結果表明，Sig=0.000<0.01，說明不同溫度處理間POD活性差異極顯著；Sig=0.001<0.01，說明種源間的POD活性差異極顯著；Sig=0.029<0.05，表明各種源與溫度交互下墨西哥柏葉片POD活性差異顯著。各種源墨西哥柏葉片的過氧化物酶活性在不同低溫脅迫下平均值大小順序為：-8 ℃、-4 ℃、-12 ℃、0 ℃。D5種源葉片POD活性最大，D1種源最小。

3結論與討論

3.1可溶性糖與抗寒性低溫脅迫初期，可溶性糖的積累是一個普遍現象。有研究發現：低溫脅迫下假儉草體內可溶性糖含量增多，其耐寒性也增強。可溶性糖能夠提高細胞液濃度，降低冰點，提高細胞內束縛水含量，保護細胞質體，增強細胞液的流動性，增強原生質粘性，細胞耐結冰能力、防脫水能力、耐凍性均變強[7]。植物的可溶性糖含量常被作為衡量植物抗寒性的重要指標，它是植物在抗寒鍛煉中，調節細胞質濃度的重要物質，具有低溫保護、防止蛋白質變性的作用，它的含量多少與植物耐寒性緊密相關。可溶性糖含量越高，植物細胞液濃度也越高，植物抵御寒冷的能力也越強[8]。

大量研究表明，隨溫度的降低，植物可溶性糖含量升高，兩者呈負相關，該試驗也得到了相似的結論。在該試驗中，10種墨西哥柏葉片可溶性糖含量在溫度逐漸降低的過程中，表現出逐漸增多的變化趨勢。在低溫脅迫初期，葉片可溶性糖含量增多，可能是因為溫度降低，植物的呼吸速率減慢，植物合成的可溶糖沒有被呼吸作用大量消耗而有所積累；也可能因為低溫導致植物淀粉水解酶大量合成，促使葉片內淀粉大量水解。到了低溫脅迫中期，植物可溶性糖含量急劇增加，可能因為植物已經對寒冷環境產生了防御，通過增加可溶性糖含量來提高細胞液濃度，保護細胞質，緩沖植物細胞質過度脫水，防止植物蛋白質失活，增強耐寒能力。在低溫脅迫后期植物葉片的可溶性糖含量增幅減慢，可能是因為低溫脅迫加劇，植物為了大量產熱而使呼吸作用增強，消耗了大量可溶性糖，因此出現可溶性糖增長緩慢的現象。該試驗發現，D4、D5、D9種源的可溶性糖含量于其他種源相比較高，可能是這3種墨西哥柏抗寒性較高的原因。

3.2可溶性淀粉與抗寒性大量研究證明，植物在不同低溫脅迫下，可溶性淀粉含量與植物抗寒性密切相關。田景花等[9]對黃瓜幼葉的低溫冷穩定性研究中表明，常溫下黃瓜幼葉淀粉粒大量積累，但是低溫下幼葉淀粉粒大量分解或消失。植物在遭遇寒冷脅迫時，可溶性淀粉含量呈下降趨勢[10]。低溫可以誘導淀粉水解酶的活性增強， 加速淀粉分解[11-12]。

在該試驗中，通過對10種墨西哥柏可溶性淀粉含量進行測定，發現各種源墨西哥柏葉片可溶性淀粉含量基本呈現“低-高-低”的變化趨勢。在0～-4 ℃間，各種源墨西哥柏葉片可溶性淀粉含量急劇下降，低溫誘導淀粉水解酶活性增強，可溶性淀粉大量水解，產生可溶性糖，增強植物細胞滲透性。-4～-8 ℃間，部分種源可溶性淀粉含量上升，可能是因為可溶性糖由于光合作用和淀粉水解的大量增加，高濃度的可溶性糖促進了可溶性淀粉的合成，也可能是低溫使植物呼吸速率降低，植物呼吸消耗的能源變少，淀粉分解量也變少。低溫脅迫后期，由于低溫脅迫加深，需要更多的可溶性糖來提供植物所需的能量，提高植物產熱，就促使植物可溶性淀粉進一步分解成可溶性糖，導致植物葉片可溶性淀粉含量下降。

3.3可溶性蛋白與抗寒性可溶性蛋白質具有滲透調節、保水及降低冰點的作用，部分可溶性蛋白還是功能蛋白酶，低溫能抑制蛋白質的合成，從而會降低植物的抗寒性[13]。但是在低溫脅迫下植物的可溶性蛋白含量與溫度的關系目前還沒有得到統一。大多學者認為低溫會導致植物可溶性蛋白含量增加，但也有學者研究發現部分植物在低溫環境下可溶性蛋白含量減少，可能是植物的含水量、成熟期、營養情況不同而導致。

該試驗對10種墨西哥柏葉片進行不同溫度梯度的人工低溫處理，通過測定其葉片的可溶性蛋白含量，發現各種源墨西哥柏葉片可溶性蛋白含量呈現“低-高-低”的變化趨勢。在低溫脅迫初期和中期，植物的可溶性蛋白含量一直增加，說明各種源墨西哥柏在逐漸適應低溫環境時，對低溫脅迫產生抵抗，通過增加葉片可溶性蛋白的含量來提高植物細胞的滲透性，防止植物脫水死亡，增加其抵御寒冷的能力，也可能因為這些蛋白是一些功能酶，它們有自己的特殊功能——增強植物的新陳代謝能力，它們的增加可以使植物在寒冷環境下快速代謝，產生能量，抵抗低溫帶來的不良反應。在低溫脅迫后期，各種源墨西哥柏葉片的可溶性蛋白含量迅速降低，可能是植物的一些蛋白質分解成氨基酸，也可能是一些合成蛋白質的酶類在低溫環境下活性降低，合成效果不佳。

3.4過氧化物酶與抗寒性過氧化物酶是植物體內普遍存在的一種保護酶，它能夠促進超氧自由基形成的H2O2降解，還可以促進分解葉綠素和生長素。當逆境脅迫時，植物體內可動員保護系統中的酶促系統和非酶促系統抵御和清除活性氧，阻止膜脂過氧化，維持膜系統的穩定性。目前，過氧化物酶與植物抗寒性的關系在多數的研究中已被證實。張瑋等[14]對麻竹的抗寒性試驗證明：在低溫脅迫過程中，過氧化物酶活性明顯提高，而且一直維持在高于對照的水平上。

在該試驗中，10種源墨西哥柏葉片在人工低溫脅迫條件下，過氧化物酶活性隨著溫度的降低大多數呈現“先上升后下降”的趨勢。D2和D7種源墨西哥柏葉片的過氧化物酶活性在0～-4 ℃間下降，可能是因為該種源墨西哥柏對寒冷的敏感性不夠強，對低溫反應較慢，還沒有產生對寒冷的抵御，在低溫下酶活性降低；其他種源過氧化物酶活性增加，可能是因為對寒冷環境產生了抵御能力，通過增加過氧化物酶活性，增強對細胞內自由基的清除能力，減少活性氧，阻止膜脂過氧化，從而保護細胞。在低溫脅迫后期，各種源葉片的過氧化物酶活性大幅度降低，可能是因為隨著低溫脅迫的加劇，植物體內的自由基大量積累，導致植物細胞膜脂過氧化嚴重，使墨西哥柏細胞膜系統遭受嚴重損壞，甚至造成細胞死亡，植物功能產生障礙。整個過程中，D5、D6和D10種源葉片過氧化物酶活性一直維持著較高的水平，說明這些種源墨西哥柏在低溫脅迫過程中，在過氧化物酶活性這一生理指標上表現出較強的抗寒性。

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