龍頭魚魚骨多糖的理化性質·結構分析及自由基清除活性研究

金鑫　張申微　牛慶鳳　李博　陳蔭

摘要[目的]為開發新的軟骨多糖資源，對龍頭魚魚骨進行多糖提取和理化性質分析。[方法] 以龍頭魚魚骨為材料，對其進行多糖的提取，并分析龍頭魚魚骨多糖的理化性質、組分結構及其體外清除自由基的活性。[結果]試驗表明，龍頭魚魚骨中含有約3%的多糖。龍頭魚魚骨多糖主要由葡萄糖組成，還含有少量的半乳糖、甘露糖、葡萄糖胺和阿拉伯糖，比例依次為為8.9∶1.0∶1.0∶1.5∶0.6；還含有5%的硫酸基團。龍頭魚魚骨多糖為混合多糖，主要含3種組分，分子量分別為780、8和4 kD。通過紅外光譜和甲基化分析表明，龍頭魚魚骨多糖以α構型為主，主要連接方式為（1→4）Glc及（1→2）Glc，多分支結構，分支多發生在（1→4）Glc的6位，還有2位和3位，分支的末端由Glc（1→、Gal（1→和Man（1→組成。此外，龍頭魚多糖具有一定的DPPH和脂質過氧化物的清除活性，半數清除濃度分別為2.35 和2.09 mg/ml。[結論]研究可為龍頭魚資源的充分利用和多糖的進一步開發提供重要依據。

關鍵詞龍頭魚；多糖；結構；自由基

中圖分類號S965.399文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）09-02722-04

基金項目教育部海洋藥物重點實驗室基金項目（201362049）；浙江海洋學院博士基金項目（21135011413）。

作者簡介金鑫（1992-），男，浙江嘉興人，本科生，專業：藥學。*通訊作者，講師，博士，從事海洋藥物研究。

收稿日期20140221 龍頭魚（Harpadon nehereus）屬狗母魚科，龍頭魚屬，也稱蝦潺，為廣分布型魚類，在我國南海、東海和黃海均有分布，是近海張網作業的主要漁獲物之一，以浙江舟山、樂清一帶產量較高。其富含蛋白質，具有維持鉀鈉平衡、消除水腫、提高免疫力、調低血壓、緩沖貧血等作用[1]。龍頭魚主要用于鮮食和加工魚粉，如何科學地充分開發利用龍頭魚資源，實現龍頭魚的高值化利用，成了亟待解決的問題[2]。龍頭魚只有一條柔軟透明的主骨，狀如粗粗的面條，和鯊魚等軟骨魚魚骨比較類似。而鯊魚軟骨中富含的鯊魚軟骨多糖，是一種具有抗腫瘤、降血脂、抗血栓和抗凝血等重要生理活性的酸性粘多糖[3]。為開發新的軟骨多糖資源，筆者就龍頭魚魚骨的多糖成分進行系統分析，為其進一步開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料龍頭魚，購于浙江省舟山市南珍菜場。色譜材料：Shodex OHpak SB804 HQ （8.0×300 mm），日本昭和；Q Eclipse XDB-C18（4.6 μm×250 mm），美國安捷倫科技有限公司。Dextran系列標準品（重均分子量分別為5.9、11.8、22.8、47.3、112.0、212.0、404.0 kD），超級純，丙烯酰胺；牛血清白蛋白（BSA）、各種單糖和糖醛酸標準品，甲叉雙丙烯酰胺，Sigma；其余試劑為分析純。

1.2方法

1.2.1龍頭魚魚骨多糖的提取[4]。取龍頭魚清凈，蒸熟后取出魚骨烘干，40 ℃烘干粉碎，90 ℃水浴浸提4 h（料液比1∶20 g/ml）后，60 ℃，pH 2，2%的木瓜蛋白酶，水浴加熱3 h，放至室溫，調pH至10，加0.5%的胰蛋白酶，水浴加熱3 h， 取出水浴加熱至100 ℃，滅酶15 min，在4 ℃ 冰箱靜置過夜，離心后將上清濃縮至原體積的1/20。用4倍體積的95%乙醇醇沉，將沉淀用無水乙醇和丙酮脫水，透析除鹽后冷凍干燥得粗多糖淡黃色粉末（HNP）。

1.2.2 龍頭魚魚骨多糖的理化性質。以葡萄糖為標準品，采用硫酸-苯酚法測定多糖總糖含量[5]。以牛血清白蛋白為標準采用Folin酚法測定多糖的蛋白含量[6]。采用明膠-比濁法測定各多糖的硫酸根含量[7]。以葡萄糖醛酸為對照，采用硫酸-咔唑法測定多糖的糖醛酸含量[8]。

1.2.3 龍頭魚魚骨多糖的單糖組成分析[9]。取適量樣品，用2 mol/L三氟乙酸在105 ℃加熱6 h進行完全酸水解后，采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測定單糖組成。

1.2.4 龍頭魚魚骨多糖的分子量測定[10]。將龍頭魚魚骨多糖用流動相配成5 mol/L的溶液，采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測定。

1.2.5 龍頭魚魚骨多糖的紅外光譜分析（IR）。取干燥的龍頭魚魚骨多糖1～2 mg與適量的KBr在鈉燈的照射下充分研磨至無明顯反光，壓制成厚度約0.1 mm的薄片，然后采用Nicolet Nexus 470紅外光譜儀在400～4 000 cm-1 范圍內掃描。

1.2.6 龍頭魚魚骨多糖的甲基化分析[11]。采用改良的Hakomori法對龍頭魚魚骨多糖進行甲基化分析。用2 mol/L TFA將甲基化的樣品完全酸水解，經硼氫化鈉還原，用吡啶和乙酸酐反應生成乙酰化衍生物，進行GC/MS分析。

1.2.7 自由基清除能力的測定[12]。

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的測定。向4.0 ml 0.004% DPPH溶液加入1.0 ml不同濃度的樣品，混勻，室溫下避光放置30 min，以相應空白溶劑為空白在波長517 nm處測定其吸光度A，計算其清除率，陽性對照為VC。

1.2.7.2 抗脂質過氧化能力的測定。分別加入1.0 ml，不同濃度的龍頭魚骨多糖溶液， 吸取 0.4 ml卵黃的懸液（V卵黃∶VPBS=1∶25）， 再加入0.4 ml 25 mmol/L 的FeSO4·7H2O，用PBS 補充至4.0 ml， 振蕩15 min，取出后加入1.0 2 結果與分析

2.1龍頭魚魚骨多糖的提取及理化性質分析通過熱水提取后，兩步酶解提取不僅可以去除殘存的蛋白，還可以使多糖類物質溶解釋放。最終龍頭魚魚骨多糖的得率為3% 左右，說明龍頭魚魚骨也存在多糖，但得率不高。對龍頭魚魚骨多糖進行理化性質分析表明，龍頭魚魚骨多糖粗品糖含量為87.2%，蛋白含量為4.6%，不含有糖醛酸，含有少量的硫酸基，含量約為5.0%。

2.2龍頭魚魚骨多糖的單糖組成分析由圖1的單糖組成分析結果表明，HNP主要含有葡萄糖（Glc），還含有少量的甘露糖（Man）、葡萄糖胺（GlcN）和半乳糖（Gal），其次還有一定量的阿拉伯糖（Arb），比例依次為8.9∶1.0∶1.0∶1.5∶0.6。從單糖組成上可以確定龍頭魚魚骨多糖不屬于硫酸軟骨素類的酸性粘多糖，因為鯊魚軟骨中酸性粘多糖的主要單糖組成是乙酰氨基半乳糖和葡萄糖醛酸，而龍頭魚魚骨多糖主要含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖這些中性糖，含有少量的堿性單糖氨基葡萄糖，唯一相似的是二者均含有少量的硫酸基。海洋動物多糖主要有兩類，一類為雜多糖，富含氨基糖、糖醛酸、甘露糖和巖藻糖；另一類則為葡萄糖，龍頭魚魚骨多糖也主要是以葡萄糖為主，也含有少量的雜多糖。注：A.PMP衍生后10種單糖標準品高效液相色譜圖；B.龍頭魚魚骨多糖PMP衍生后高效液相色譜圖；Man.甘露糖；GlcN.氨基葡萄糖；Rha.鼠李糖；GlcA.葡萄糖醛酸；GalA.半乳糖醛酸；Glc.葡萄糖；Gal.半乳糖；Xyl.木糖；Arb.阿拉伯糖；Fuc.巖藻糖。

2.3龍頭魚魚骨多糖的分子量分布由圖2可知，HNP是混合多糖，色譜峰不均一，主要含有3種主要組分。以分子量為5.9、9.6、21.1、47.1、107.0、200.0、344.0和708.0 kD的葡聚糖為標準品，以各自在HPGPC上的保留時間為橫坐標，對數值為縱坐標繪制標準曲線，得到計算公式為y=-0.314 4x+9.359 9，R2=0.995 1。把樣品所對應保留時間帶入，計算得到，HNP分子量分布比較分散，差異較大，主要含有分子量為780.0 kD的高聚糖及2個分子量分別為8和4 kD的低聚糖。多糖分子量的兩極分化在很多動物多糖如貽貝多糖中也有體現[13]。

2.4龍頭魚魚骨多糖的紅外光譜分析 HNP的紅外光譜如圖3所示，是典型的多糖紅外光譜。3 402 cm-1處的信號為多糖羥基的伸縮振動吸收峰；在2 930 cm-1附近處的信號為糖環上的次甲基和亞甲基中的C-H伸縮振動的吸收峰；1 021、1 085和1 159 cm-1處的吸收信號為C-O和C-O-C的伸縮振動，三者同時存在表征了吡喃糖環的伸縮振動峰；846 cm-1處的吸收表明糖基中存在α 構型；932 cm-1處的吸收表明葡聚糖為D構型；1 644 cm-1處的吸收為多糖類物質常見的微量水分締合羥基造成。由此可以初步推測，HNP主要由αD吡喃葡萄糖構成[14]。

2.5龍頭魚魚骨多糖的GCMS分析為確定多糖的連接方式，對龍頭魚魚骨多糖進行甲基化后GC-MS分析（圖4）。甲基化分析仍然是確定多糖結構的重要方法。甲基化分析結果如表1所示，HNP連接方式較復雜，Man和Gal主要存在于非還原末端，以Man（1→和Gal（1→形式存在。Glc主要存在→4）Glc-（1→和→4，6）Glc-（1→連接方式，和淀粉、糖原等能量物質類似，但還存在少量的→2）Glc-（1→、→3，4）Glc-（1→、→2，4）Glc-（1→及末端葡萄糖Glc（1→。龍頭魚魚骨多糖遇碘不變色，說明龍頭魚魚骨多糖并不是糖原類物質。龍頭魚魚骨多糖中葡萄糖的連接方式與很多海洋動物多糖如紫貽貝多糖及扁玉螺多糖比較接近[15-16]，主要含有→4）Glc-（1→，且具有多分枝結構，分支可能為→4）Glc-（1→的2位、3位和6位。

2.6龍頭魚魚骨多糖清除自由基能力測定 海洋多糖具有生物活性，如增強免疫調節、降血糖、調血脂、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血、抗衰老、抗炎等[17]，在功能性保健食品和創新藥物的研究與開發方面具有良好的應用前景。清除自由基活性與抗腫瘤及抗衰老等活性相關。為促進對龍頭魚魚骨多糖藥用價值的深入研究，試驗對龍頭魚魚骨多糖進行初步的清除自由基能力測定。

3 結論

龍頭魚只含有一根主要透明柔軟的魚骨，與軟骨魚類相似，為探索其魚骨中是否含有硫酸軟骨素資源，對龍頭魚魚骨多糖進行基本研究。通過木瓜蛋白酶和胰蛋白酶兩步酶解法對魚骨進行提取，發現龍頭魚魚骨中確實存在多糖成分，含量約為3%，對其進行理化性質分析確定其多糖成分不屬于硫酸軟骨素類成分。龍頭魚骨多糖單糖組成主要為葡萄糖，并含有一定的甘露糖、半乳糖，還含有少量的葡萄糖胺和阿拉伯糖。多糖中不含有糖醛酸成分，含有5%硫酸基。龍頭魚魚骨多糖和很多動物多糖比較形似，分子量分布兩級分化，主要含有一個分子量超過700 kD的高聚多糖和2個分子量分別8和4 kD的低聚多糖。通過紅外光譜和甲基化后GC-MS分析對龍頭魚骨多糖進行初步結構分析表明，龍頭魚骨多糖主要以α構型為主，連接方式以→4）Glc-（1→為主，富含分支結構，分支主要存在于→4）Glc-（1→的6位和2、3位，還含有少量的→2）Glc-（1→。多糖分支的末端以葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成。對龍頭魚骨多糖進行初步的自由基清除試驗表明，龍頭魚骨多糖對DPPH自由基和脂質過氧化物均具有較好的清除能力，且呈劑量依賴關系，其半數清除濃度分別為2.35和2.09 mg/ml。

海洋動物多糖資源主要包括軟體動物多糖、海參多糖和鯊魚軟骨多糖，很少對硬骨魚類魚骨多糖成分進行研究。該研究對產自舟山海域的龍頭魚骨多糖分析表明，硬骨魚魚骨中也存在一定量的多糖，但和軟骨魚富含硫酸軟骨素相比有很大差別，其富含葡聚糖，且具有一定的自由基清除能力。該研究不僅拓展了海洋動物多糖的研究范圍，開發新的多糖資源，還為龍頭魚骨多糖的進一步分離純化和生物活性研究提供依據，對龍頭魚的高值化利用具有重要參考意義。

參考文獻

[1] 韓素珍，董明敏.龍頭魚Harpadon nehereus營養成分的分析[J].浙江水產學院學報，1994，13（1）：12-17.

[2] 靳挺，武玉學，徐東.龍頭魚海鮮調味料的制備研究[J].中國食品學報，2010，10（1）：127-132.

[3] 陳守平，許永安.硫酸軟骨素提取工藝及藥理學作用的研究進展[J].福建水產，2007（2）：63-66.

[4] 許靜，周鳳梅，彭芳，等.酶法提取海參臟器多糖條件優化研究[J].食品研究與開發，2010，31（8）：28-30.

[5] DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Anal Biochem，1956，28（3）：350-356.

[6] LOWRY R，RAMDALL F.Protein measurement with the Folin Phenol reaction[J].Biol Chemical，1951，193：265-275.

[7] TERHO T T， HARTIALA K.Method for determination of the sulfate content of glycosamino glycans[J].Analytical Biochemistry，1971，41：471-477.

[8] BLUMENKRANTZ N，ASBOEHANSEN G.New method for quantitative determination of uronic acid[J].Analytical Biochemistry，1973，54：484-489.

[9] CHEN Y，MAO W J，YANG Y P，et al.Structure and antioxidant activity of an extracellular polysaccharide from coralassociated fungus，Aspergillus versicolor LCJ54[J].Carbohydrate Polymers，2012，87：218-226.

[10] 趙峽，苗輝，范慧紅，等.用GPC法測定硫酸多糖911的分子量和分子量分布[J].青島海洋大學學報：自然科學版，2000，30（4）：623-625.