豬圓環(huán)病毒Ⅱ型全基因組的克隆和序列分析

毋艷萍

摘 要：根據(jù)Genbank已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV-2）全基因組序列，設計兩對特異性引物，建立了PCV-2全基因組的克隆和序列分析方法，并對甘肅省兩個規(guī)模化養(yǎng)豬場采集的疑似PMWS病料進行了全基因克隆和序列分析，確定了PCV-2毒株基因序列的變異情況。結果表明，PCV-2核苷酸序列穩(wěn)定，1株標準株與2株分離株全基因序列均由1 768 bp組成，彼此間序列的同源性達94.0 %～99.8 % ，2個分離株之間同源性達94.2 %～99.8 %；分離株與標準株和Genbank已發(fā)表的23株PCV-2毒株參考毒株同源性達92.6 %～100 %。

關鍵詞：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型；全基因組；序列分析

中圖分類號：S852 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）05-0050-04

豬圓環(huán)病毒為圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬、單股環(huán)狀無囊膜的DNA病毒，是已知最小的動物病毒之一[1]。根據(jù)其病致性、抗原性及核苷酸序列可分為PCV-1和PCV-2兩個血清型。PCV-1無致病性，可以持續(xù)感染PK-15細胞，但不引起細胞病變，廣泛存在于正常豬體各器官及豬源細胞。PCV-2有致病性，與世界各國發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征密切相關[2]。該病1991年在加拿大首次報道，主要感染5～12周齡仔豬，發(fā)病率為20 %～60 %，致死率可達100 %。臨床主要表現(xiàn)為漸進性消瘦、呼吸困難、皮膚蒼白、黃疸、肝硬變、腹瀉，剖檢可見淋巴組織退化、間質性肺炎、肝炎及腎炎等癥狀。除斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征以外，豬皮炎與腎炎綜合征、豬繁殖障礙疾病、豬呼吸道疾病綜合征、腸炎等疾病，也被證實與豬圓環(huán)病毒感染有重要關聯(lián)。自1996年以來，該病呈世界性分布，法國、西班牙、英國、美國、北愛爾蘭等國家均報道豬群中存在PMWS。亞洲地區(qū)的日本、韓國、中國及臺灣省也有發(fā)病報道。PCV-2既可水平傳播，引起斷奶仔豬發(fā)病死亡；亦可垂直傳播，引起母豬繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失，已引起世界各國的廣泛重視。

PCV-2基因組全長為1 767 bp或1 768 bp。PCV-1和PCV-2核苷酸同源性為68 %，其基因組結構相似，PCV-2基因組包含11個開放閱讀框（ORF1-11），各閱讀框之間大小差異懸殊[2]。其中含有兩個最大的開放閱讀框：ORF1和ORF2，其中ORF1變異很小，同源性為85 %，主要編碼與病毒復制有關的Rep蛋白，ORF2變異較大，編碼病毒的結構蛋白Cap，此蛋白是病毒衣殼蛋白的主要成分，具有較好的抗原性，因此PCV-2Cap蛋白可作為診斷PMWS的特異性抗原[3]。研究還表明PCV-1與PCV-2有一定親緣關系，但也發(fā)生了較大的變異。

目前PCV-2在國內廣泛流行[4]，了解我國不同地區(qū)PCV-2毒株間的遺傳差異對預防和控制PCV-2的流行具有重要意義。為此對來自甘肅省規(guī)模化養(yǎng)豬場采集的疑似PMWS病料進行了全基因克隆和序列分析，確定PCV-2毒株基因序列的變異情況，為甘肅省PCV-2毒株的分子流行病學及毒株來源的研究奠定 基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株

PCV-2毒株標準株、甘肅株，分別命名為BZ株、GS1和GS2株，標準株由農業(yè)部獸醫(yī)診斷中心提供的細胞毒；GS1和GS2株均為組織毒，由甘肅省動物疫病預防控制中心提供。

1.1.2 試劑

Taq聚合酶和dNTP購于上海生工生物工程技術服務有限公司；PGEM- T-easy載體試劑盒購于華美生物工程公司；感受態(tài)細菌DH5α購自北京全式金生物技術有限公司；E.Z.N.A.? Gel Extraction kit DNA凝膠回收試劑盒為美國Omega Bio-Tek公司產品；蛋白酶K購自德國MERCK公司；LB培養(yǎng)基，英國產；X-gal和IPTG為Sigma公司產品；其它常用試劑如組織細胞裂解液、TE、0.5×TBE緩沖液、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基等均按照《分子克隆實驗指南》配制。

1.1.3 儀器

PCR儀；電泳儀、凝膠成像儀；搖床；低溫高速離心機；二級生物安全柜等。

1.2 方法

1.2.1 引物

根據(jù)GenBank中發(fā)表的PCV-2核苷酸全序列，自行設計兩對引物A1、A2與B1、B2，此引物分A、B兩段通過PCR技術擴增出PCV-2的全基因組。

引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用前溶解于滅菌的ddH2O，濃度為64 pmol/L，-20 ℃保存。

1.2.2 樣品總DNA的提取

根據(jù)資料介紹的方法，取肺織或淋巴結組200 mg左右置于研磨器中剪碎并研磨，加入2 mL消化液繼續(xù)研磨，取已研磨好的待檢病料上清100 μL，再加入500 μL消化液和蛋白酶K10 μL，混勻，置55 ℃水浴中消化4～16 h以上（隔一定時間混勻一次）；細胞培養(yǎng)液提取DNA時不用蛋白酶K且無需消化過夜；取上述處理好的樣品，加入等體積即600 μL的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）混合液用力顛倒混勻，12 000 r/min 離心10 min；將上清液500 μL轉移至另一個新的離心管中，加等體積異丙醇混勻，置液氮中1 min，室溫溶化，13 000 r/min 離心15 min；爾后加入1 mL以 75 %冷乙醇13 000 r/min 離心15 min洗滌；棄上清，金屬浴55 ℃15 min溫育晾干乙醇；加入50 μL滅菌水或TE溶解沉淀，作模板保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 全基因片段的PCR擴增

20 μL反應體系：

在0.5 mLEppendorf管中依次加入以下組分：

1.2.4 A、B段PCR產物的克隆及鑒定

1.2.4.1 PCR產物的回收與純化

參照E.Z.N.A.? Gel Extraction kit DNA凝膠回收試劑盒說明書進行。

1.2.4.2 PCR產物的連接

將回收的PCR擴增產物分別與PGEM- T-easy載體連接。連接反應的組成為：

1.2.4.3 連接產物的轉化

將1.2.4.2中連接后的DNA產物進行轉化。步驟簡述 如下：

（1）從-70 ℃冰箱中取出感受態(tài)細胞，冰浴上溶化，取50 μL加入到連接管中，輕輕混勻，冰浴中放置30 min；

（2）將離心管放入42 ℃水浴中熱激30 s，爾后將離心管快速移至冰浴中2 min；

（3）每管加500 μL無菌的LB培養(yǎng)基，混勻后置37 ℃，225 r/min搖床上，培養(yǎng)1 h，使細菌復蘇；

（4）每管加入X-gal 10 μL ，IPTG 20 μL，混勻，選擇吸取不同體積（一般取400 μL）菌液涂布于含有50 mg/mL Amp的LB瓊脂板上，倒置平皿于37 ℃溫箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.4.4 挑菌鑒定

備齊用具，從Amp LB平板上挑取白色中等大小的菌落，接種于4 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，225 r/min搖床培養(yǎng)2～4 h，供保種測序之用。

1.2.4.5 PCR鑒定

將目的DNA按1：5用dd H2O稀釋，取2.0 μL作為模板進行鑒定，同時設不加模板的空白對照，反應體系為：

將以上各組分混勻，瞬時離心，在核酸擴增儀中運行以下程序：

95 ℃預變性3 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸45 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，末輪循環(huán)后置4 ℃保存。

反應結束后，取12 μLPCR產物于1.5 %瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

1.2.5 A、B段基因序列的測定

將經PCR鑒定的陽性菌液送上海英駿生物技術有限公司北京實驗室測序。每個插入片段從正反兩個方向測通后，驗證無誤，確定為所需基因序列。

1.2.6 A、B段基因序列測定結果的分析

對測序結果用DNAMAN軟件進行拼接，獲得PCV-2全基因序列，并將測定的3株PCV-2全基因序列和GenBank上已發(fā)表的PCV-2參考毒株進行核苷酸同源性分析，繪制相關遺傳關系發(fā)育樹。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

2.1.1 A段PCR擴增結果

A段PCR產物于1.5 %瓊脂糖凝膠中電泳，在790 bp處有一特異性條帶，與預期結果一致（圖1）。

2.1.2 B段PCR擴增結果

B段PCR產物于1.5 %瓊脂糖凝膠中電泳，在1 012 bp處有一特異性條帶，與預期結果一致（圖2）。

2.2 A、B段基因的克隆鑒定

擴增的PCR產物經連接轉化進行PCR擴增，結果分別在 990 bp和1 212 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預期結果一致（圖3、圖4）。

2.3 A、B段基因的序列測定

A段基因核苷酸序列長度皆為790 bp，B段基因核苷酸序列長度皆為1 012 bp，用DNAMAN軟件進行拼接后，獲得PCV-2全基因序列長度標準株與甘肅株均為1 768 bp。

2.4 PCV-2全基因序列分析

PCV-2各個分離株之間在進化上存在著某些地理位置上的相關性，分為兩大主支[5-7]。一支以北美洲分離株為主，主要為加拿大和美國分離株；另外還有日本、韓國、西班牙、中國及臺灣毒株。另一支以歐洲分離株為主，主要為法國分離株，另外有部分中國毒株。全基因核苷酸序列比較結果表明：本研究的2個分離株之間的全基因核苷酸序列同源性在94.2 % ～99.8 %之間，與23個PCV2毒株（EU547460 GS12甘肅、EU418627 TangHe河南、DQ915588 GRE、EU136720 PCV2herd D丹麥、EF592576 HLJ1廣東、EF210106 ZheJiang2006、DQ910866 HSH1河北、DQ861902巴西、DQ195679 上海、AY686764 ZJ、AY578327 JS2003 from China、AY556477 HuNan、AY556476 HaiNan、AY556475 GX、AY556474 FJ、AY556473 SD、AY536756 HuZhou0301、AY536755 SX0201、AJ293869英國、AY321982法國）進行同源性分析，同源性達92.6 %～100 %。與（AF520783韓國、DQ397521美國、AY294310 PCV2-JX中國）同源性較差。同源性分析表明，所測定的2個分離株與歐洲株、法國株及部分中國株在同一個大分枝上；而與韓國、美國相對較遠。BZ株與AY556473 SD關系較密切，GS1株、GS2株與EU547460 GS12甘肅關系較密切（表1、圖5）。雖然并無證據(jù)表明不同的毒株免疫原性有差異，但在選PCV2疫苗免疫時，建議盡量使用國內生產的疫苗進行免疫。

3 討論與分析

3.1 引物的設計

PCV-2的全基因組有兩種，1 767 bp和1 768 bp，皆為單股環(huán)狀DNA。根據(jù)基因序列比較，二者的差別在于，其序列在1 040 bp處缺失一個堿基。本試驗在設計引物時，設計了A、B兩對引物分兩段擴增PCV-2全基因序列。A引物對為UA—816 bp至836 bp，引物長度21 bp，DA—1 585 bp至1 605 bp，引物長度20 bp，A對引物擴增從816 bp至1605 bp的基因片段，理論跨度為790 bp；B引物對為UB—1 591 bp至1 609 bp，引物長度18 bp，DB—817 bp至835 bp，引物長度18 bp，B對引物擴增從817 bp至1 591 bp的基因片段，理論跨度為1 012 bp。兩對引物都避開了堿基缺失部分，這樣在進行PCR擴增時，不論是1 767 bp還是1 768 bp，均能擴增出來。結果證實，本試驗建立的方法真實可靠，擴增的標準株與分離毒株全基因序列均為1 768 bp。

有資料表明設計一對引物從同一點向兩端采用背對背的方法擴增PCV-2的全基因序列。此方法雖然省去了后期進行的序列拼接，但由于所擴增的目的片段過長，試驗中需要反復優(yōu)化實驗條件，PCR過程中極易出現(xiàn)堿基錯配現(xiàn)象，難以保證擴增結果的保真度；同時也會造成擴增效率的低下。本試驗分A、B兩段擴增，目的片段為790 bp和1 012 bp，均在有效擴增范圍，堿基錯配率極低，重復試驗好。況且后期的序列拼接借助DANMAN分析軟件進行，不是很繁瑣。實驗的目的是序列的克隆與分析，保證擴增的堿基序列與模板序列的一致性才是本試驗的重點，試驗方法可信，試驗結果真實、可靠。

3.2 序列的比較分析

本試驗通過PCR方法獲得了3株PCV-2的全基因序列，和GenBank上發(fā)表的PCV-2全基因序列進行核苷酸序列同源性比較，并繪制遺傳關系發(fā)育樹。

3.3 分子流行病學分析

PCV-2的ORF2編碼序列比較分析表明，存在著3個主要變異區(qū)域（59位～90位，121位～136和190位～210位氨基酸），而其中有2個（59位～90位和121位～136位氨基酸）與免疫表位（65位～87位和113位～147位氨基酸）相關，這些表位暴露于免疫壓力下，有可能會發(fā)生突變，導致新的毒株出現(xiàn)，這為疾病的預防和控制帶來了更大的難度。

本研究的2個分離株與1個標準株，它們與法國株關系密切，而法國是較早發(fā)生PCV-2病的國家之一，早在1986年可能就有本病的發(fā)生[8-10]。比較的幾個法國毒株分離自1995年發(fā)病的豬只。而我國乃至我省卻是最近幾年才有PCV-2病的發(fā)生，這可能是由于前些年從歐洲引進豬種，而所引進豬種體內本來就存在PCV-2所致。推測當時（20世紀80年代末90年代初）由于養(yǎng)殖業(yè)剛剛起步，飼養(yǎng)規(guī)模小、飼養(yǎng)環(huán)境較好污染不嚴重、疾病種類不多，疫苗接種還不頻繁，病毒缺乏共刺激等因素，不能導致疾病發(fā)生[9]。但病毒在豬體內長期存在，并與宿主共同演化，演化的結果產生了微小的變異。近十年來隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷擴大，新病不斷出現(xiàn)，尤其是豬繁殖與呼吸綜合征最近幾年的暴發(fā)與流行。加之疫苗接種的日齡不斷提前、疫苗種類的不斷增多。這些因素可能上調了PCV-2在體內的復制，導致了疾病的發(fā)生[11-13]。

3.4 PCV-2感染能夠引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎和腎病綜合征、豬繁殖障礙，吸吸道疾病等，且常和PRRSV、PPV、PRV等病毒混合感染造成更大的經濟損失，因此研制PCV-2的診斷試劑和疫苗是當務之急。本試驗結果明確了目前甘肅省PCV-2流行毒株基因組的分子學特征，毒株間親緣關系密切，變異度不大。□□

參考文獻：（13篇，略）