自體DC—CIK細胞聯合替吉奧治療中晚期肝癌的療效觀察

梁倩影　劉先領

【摘要】目的：觀察中晚期肝癌患者行自體DC-CIK細胞聯合替吉奧治療的臨床療效及不良反應。方法 采集48例中晚期原發性肝癌患者外周血單個核細胞，加入細胞因子定向誘導DC及CIK，8d后將擴增的DC及CIK細胞以靜脈回輸的方式，對患者進行自體DC-CIK細胞輸注治療，同時聯合口服替吉奧治療。結果 自體DC-CIK聯合替吉奧治療12周后CR0例PR10例，SD22例，PD16例，總有效率（RR）為20.8%，疾病控制率（DCR）為66.7%。患者免疫功能提高，生活質量改善。結論 自體免疫細胞聯合替吉奧治療中晚期肝癌療效尚可，副作用小，安全性好。

【關鍵詞】樹突狀細胞（DC）；細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK）；替吉奧；肝癌；

【中圖分類號】R9145 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）04-0150-02

原發性肝癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，全球發病率逐年上升，已超過62.6萬/年，而我國占全球總數的55%，每年約有30萬人死于肝癌，在腫瘤相關死亡中位居第二為，僅次于肺癌[1]。盡管外科手術水平和肝癌移植技術已經取得了巨大的進步，但由于肝癌起病隱匿，侵襲生長迅速，80%以上的肝癌患者在確診時已存在肝癌播散、遠處轉移、門脈癌栓或伴有嚴重的肝硬化，不能進行手術，甚至是介入、微波等治療均存在限制，包括全身化療在內的非手術療法仍不失為延長生存、提高生活質量的重要方法。隨著替吉奧、卡培他濱等新型化學治療藥物的問世，口服單藥化療逐漸成為臨床上采用的姑息性治療方法[2]。腫瘤生物免疫治療做為一種新興的治療手段成為近年來腫瘤治療領域關注的熱點問題。樹突狀細胞（Dendritic cells DC）是目前已知體內功能最強的抗原提呈細胞。細胞因子誘導的殺傷細胞（Cytokine-induced killer cells CIK）是一種在體外經細胞因子誘導、增殖而得的具有抗瘤譜廣、殺瘤活性高的特性的免疫活性細胞。為此，本研究采用DC-CIK自體免疫細胞聯合替吉奧治療48例中晚期肝癌患者，取得一定療效，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料

1.1.1 入選標準：（1）經影像學或病理活檢確診的中晚期肝癌患者，無法行手術治療，不適合或不考慮行肝動脈栓塞化療者；（2）患者自愿接受上述治療并簽署同意書；（3）肝功能Child-Pugh分級為A或B患者；（4）各項常規、生化檢查指標無相關禁忌癥；（5）Kamofsky評分≥60，無嚴重的心、肺、腎功能障礙及全身惡液質情況；（6）預計生存期大于3個月；（7）無明顯感染，無精神類疾病。

1.1.2 研究對象：我科2011年1月-2013年5月經檢查確診為中晚期肝癌的患者48例，其中男34例，女14例，年齡31-72歲，平均年齡48.6歲，經影像學或病理活檢確診但無法行手術治療，不適合或不同意行肝動脈栓塞化療者。巨塊型肝癌26例，多發結節型肝癌22例，其中外科手術失敗或術后復發患者占9例。患者肝內病灶大小在2×3cm-13.0×15.1cm之間，含肝硬化、門靜脈及下腔靜脈癌栓、腹腔積液、黃疸、遠處轉移者。28例病例有原發病或/和轉移瘤的病理學或組織細胞學證據，所有病例均有相應的影像學資料，有可見原發灶或/和轉移病灶可供評估療效。

1.2 治療方法

所有入組病例均先行外周血單核細胞采集，標本送實驗室行DC-CIK細胞培養及擴增，后開始口服替吉奧治療，細胞培養完成后安排自體DC-CIK細胞輸注治療。12周為1個療程，如無明顯不良反應則重復療程。治療期間每周查血常規1次，每2周查肝功能1次，白細胞計數<3×109/L或肝功能異常時停藥2周后進行評價，對藥物反應性好及可耐受治療者停藥2-4周后可繼續治療。

1.2.1 替吉奧（S-l）治療

根據體表面積來確定初始劑量，體表面積<1.25m2，S-l 40mg/次，2次/d；體表面積1.25～1.5m2，S-1 50mg/次，2次/d；體表面積>1.5m2，S-l 60mg/次，2次/d，早飯后和晚飯后分別口服1次，連續服用28 d（4周），停藥14d（2周）。12周為1個療程。

1.2.2 DC-CIK治療

（1）細胞分離 經CS-3000血細胞分離機采集患者外周血5L中的新鮮抗凝外周血單核細胞，再用聚蔗糖400（Ficoll 400）分離后經Hank′s液洗3次，收集純度在90%以上的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMNC）。

（2）CIK體外培養和擴增 將PBMNC加入到含1000U/mL IFN-γ和自體血清的完全培養基中，調整細胞濃度至2.0×106個/mL，24h后加入IL-2 1000U/mL和CD3單抗0.5 μg/mL，后根據CIK生長情況每隔2d～3d適時補充培養基和IL-2，置于37°C，5%CO2培養箱中培養10d～14d后。每周2次測定白細胞增殖率和CD3、CD56陽性細胞率，當細胞數擴增達到設計目標，陽性目標細胞達到85%時，離心收集細胞，同時取樣做質量檢控（參照柯萊遜《質量檢控標準》CLS-T-W-009）。將合格的CIK分4次靜脈回輸至患者體內，單次回輸CIK數目不少于1.0×109個。

（3）DC體外培養和擴增 將CS-3000分離的到的PBMNC用無血清1640培養液重懸，濃度為2×106/ml鋪入6孔板，孵育2h后棄上清，獲得貼壁單核細胞，加入DC完全培養基（含GM-CSF 100ng/mL和IL-4 500U/mL），置于37°、5%CO2培養箱中；培養第5d加入TNF-α誘導DC成熟，第7～8d收集懸浮的DC，同時取樣做質量檢控（參照柯萊遜《質量檢控標準》CLS-T-W-009）。將合格的DC分4次靜脈回輸至患者體內，單次回輸DC數目不少于1.0×107個。

（4）細胞回輸方案 患者一般狀況良好，細胞培養成熟后開始交替回輸CIK和DC，2～3次/周，一次回輸CIK不少于1×109個，DC不少于1×107個。

（5）外周血免疫功能檢測 細胞治療前及治療完成4周后檢測患者外周血T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD16+CD56+、CD4+/CD8+）變化。

1.3 觀察及療效評估

觀察指標包括治療前后瘤體變化、外周血免疫指標、腫瘤標志物、癥狀改變、生活質量及不良反應等。療效評估采用美國癌癥研究所制定的實體腫瘤RESIST療效評估方法，將療效分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩定（SD）、進展（PD），總有效率（RR）=CR+PR，疾病控制率（DCR）=CR+PR+SD[5]。記錄患者治療前后食欲、睡眠、精神、體力等情況，用 Karnofsky 計分法（見附錄B）判斷治療前及治療后生活質量的改善情況，凡在治療后較治療開始前計分提高10分以上者為改善，下降10分以上者為惡化，提高或下降10分者為穩定，總提高率=（改善+穩定）×100%。不良反應按WHO抗腫瘤藥物不良反應的分度標準，分為0～Ⅳ度[5]。

1.4 統計學方法

實驗數據采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，采用配對t檢驗進行比較。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 瘤體變化

48例中晚期肝癌病例均有可測量病灶，經DC-CIK聯合替吉奧治療1周期（12周）后，采用彩超、CT、MRI等影像學檢查方法測量病灶大小，按RESIST實體瘤的近期療效標準，其中CR 0例，PR 10例，SD 22例，PD 16例，總有效率（RR）為20.8%，疾病控制率（DCR）為66.7%。

2.2 外周血免疫指標變化

接受DC-CIK聯合替吉奧細胞治療的48例中晚期肝癌患者，其治療前后外周血免疫指標分析結果顯示：總T淋巴細胞（CD3+）、T輔助細胞CD4+百分率，CD4+/CD8+比值明顯上升，與治療前對比差異有統計學意義（P﹤0.05），NK細胞（CD16+CD56+）比例較前上升，T毒性/抑制細胞（CD3+CD8+）較前下降，但P﹥0.05（見表1）。

2.3 臨床癥狀緩解情況

48例中晚期肝癌患者經1療程（12周）治療后在乏力、食欲不振、疼痛腹水、黃疸、腹脹等方面得到明顯緩解。（見表2）

2.4 KPS評分變化情況

經積極治療后，大部分患者的KPS評分均得到提高，平均提高10～20分，總提高率高達89.6%。

2.5 毒副反應

主要的不良反應是中性粒細胞減少、消化道反應及皮膚色素沉著，其中Ⅰ度粒細胞減少者6例，Ⅱ度減少2例，無Ⅲ、Ⅳ度減少者，經粒細胞集落刺激因子（G-CSF）治療后粒細胞計數恢復正常，不影響繼續用藥。6例患者出現惡心癥狀，2例患者出現短暫嘔吐，48例患者均未出現Ⅲ度及以上消化道反應。3例患者治療后出現丙氨酸氨基轉移酶（ALT）輕度升高，加強護肝治療后ALT恢復正常并完成治療。4例患者回輸DC-CIK細胞后出現發熱，體溫均低于38.6℃，持續時間2～6小時，有1例給予酚咖片處理外，其他3分自行緩解。

3討論

晚期原發性肝癌至今尚沒有標準的治療方案，與手術及介入治療相比，肝癌的全身化療始終處于艱難的探索中。其重要原因之一是肝癌細胞存在著多種耐藥機制，如多藥耐藥基因及其蛋白的高表達、p53基因突變、bcl-2和bc-lxl的異常表達等。另外，還存在著與谷胱甘肽-S-轉移酶、拓撲異構酶和熱休克蛋白等相關的耐藥[2]。化療的目的是提高患者的生存質量，延長患者的生存期。首選有效性的同時，還應對藥物的副反應進行比較，特別是原發性肝癌患者，應該選擇毒副反應小藥物用于治療。

替吉奧是一種氟尿嘧啶衍生物口服抗癌劑，是替加氟（FT）、吉美嘧啶（CDHP）和奧替拉西鉀（Oxo）三種藥物組成的復方制劑，組成摩爾比1：0.4：1.FT是5-FU的前體藥物，口服吸收經肝藥酶作用持續轉化為5-FU。CDHP是二氫嘧啶脫氫酶的強效抑制劑，可延長血液和腫瘤組織中的5-Fu的藥效時間，從而取得與5-Fu持續靜脈輸注類似的療效。Oxo能夠阻斷5-Fu的磷酸化，減輕了5-Fu引起的胃腸道不良反應。替吉奧與5-Fu相比具有以下優勢：①能維持較高的血藥濃度并提高抗癌活性；②明顯減少藥毒性；③給藥方便。替吉奧在胃癌上已顯示較好的療效，甚至可以與聯合方案相媲美，在原發性肝癌的小樣本研究中也顯示出可喜的效果，且與5-Fu不完全交叉耐藥[3]。

乙型肝炎病毒慢性感染是我國肝癌的主要致病原因，患者體內存在有不同程度的免疫功能缺陷。研究顯示[4]，肝癌患者存在外周血DC成熟障礙狀況，主要表現為循環DC低表達MHC-Ⅱ和IL-12；攝取抗原顆粒以及同種T細胞刺激能力下降。我們應用的DC是經過體外活化和擴增，并經過肝癌組織特異性抗原（AFP）刺激的成熟DC，國外實驗證明，用AFP致敏的DC可抑制肝細胞癌的生長，且對正常肝細胞的再生沒有影響[5]。我們應用的CIK細胞是將人外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子（如抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ等）共同培養一段時間后獲得的一群高數量細胞群，單個療程可達1×109個，CIK兼具有淋巴細胞強大的殺瘤活性和NK細胞的非主要組織相容性復合體限制性殺瘤特點。它是迄今發現的所有免疫效應細胞中，增殖能力最強、細胞毒活性較強的細胞。DC和CIK細胞是腫瘤免疫治療的兩個重要部分，二者聯合可以有效提高機體的免疫功能，改善生存質量，延長生存期，同時增加化療敏感性，降低化療不良反應。以往認為化療主要對機體產生免疫抑制的負面影響。然而，近幾年來借助新的研究技術和較理想的動物模型，對化療和免疫反應的相互作用有了更深入的了解，認為化療對腫瘤的免疫功能存在雙重的影響。而替吉奧為氟尿嘧啶類的氟化物，通過在體內轉化為5-FU，可作為一種免疫調節劑，5-FU通過誘導腫瘤細胞的抗原及MHC分子的表達，從而恢復CTL對靶細胞的特異性殺傷活性。通過選擇性清除MDSCs（Myeloid-derived suppessor cells 髓系來源抑制細胞），提高后續免疫治療的療效。本研究發現，通過應用自體DC-CIK聯合替吉奧治療，中晚期肝癌患者CD3+T淋巴細胞、CD4+Th細胞、CD4/CD8比率都有不同程度的增加，呈顯著性差異（p<0.05）。說明DC-CIK能夠增強機體的細胞免疫功能，改善機體的免疫抑制狀態，這與文獻報道一致[6]本研究結果還發現，經過積極的DC-CIK聯合替吉奧治療后，患者的體能狀況KPS評分有所提高，總得提高率為90.5%，并且在臨床癥狀方面，明顯改善患者的疲乏、食欲不振、腹脹等癥狀。雖有部分患者有出現白細胞減少、消化道等不良反應，但都比較輕微，經短期處理后均可緩解。

綜上所述，自體免疫細胞DC-CIK聯合替吉奧治療中晚期肝癌，具有較好的抗腫瘤作用及輕微的毒副反應，改善患者生活質量，安全性高，是中晚期肝癌治療的新選擇。但本研究的病例數較少，觀察時間短，未能隨訪到生存時間，其臨床效果尚需大樣本前瞻性、對照的臨床試驗來進一步證實。

參考文獻

[1].El-Serag HB， Rudolph KL.Hepatocel lular carcinoma： epidemiology and molecular carcinogenesis[J].Gastroenterology，2007，132：2557～2576.

[2].錢軍，秦叔逵.原發性肝癌的系統性化療[J].消化腫瘤雜志（電子版），2009，1（2）：130-135.

[3].Moirse Z， Sugioka A， Fujita J，et al. S-1plus cisplatin combination therapy for the patients with primary liver carcinomas[J]. Hepatogastroenterology.2007， 54（80）： 2315-2318.

[4] .EliGilboa. DC-based cancer vaccines [J]. J Clin Invest， 2007， 117（5）： 1195-1203.

[5].王廣偉， 顧元龍， 劉敏豐. 負載自身腫瘤裂解物的樹突狀細胞聯合殺傷細胞對肝癌患者術后免疫功能的影響[J]. 中華普通外科雜志， 2012， 27（4）： 337-338.

[6].Vincent J，Mignot G， Chalmin F， et al. 5-Fluorouracil seleetively kills tumor-assoeiated myeloid-derivedsuppressor cells resulting in enhanced T cell-dependent antitumor immunity[J]. Cancer Res， 2010， 70（8）： 3052-3061.