依達拉奉對大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Caspase-3表達的影響

潘 登譚 軍

（1 新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003）

依達拉奉對大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Caspase-3表達的影響

潘 登1譚 軍2

（1 新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003）

目的 觀察依達拉奉對大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Caspase-3表達的影響。方法 72只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（S組）、缺血對照組（IR組）和依達拉奉治療組（P組）（每組24只），利用大腦中動脈栓線阻斷法制作大鼠局灶性腦缺血2 h后再灌注損傷模型，以免疫組化染色，依術(shù)后處死動物時間不同，在缺血再灌注后不同時間點2、24、72 h（每組8只）觀察各組大鼠大腦神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Caspase-3表達的不同。結(jié)果 在不同時間點依達拉奉治療組大鼠Bcl-2陽性細胞表達的數(shù)目高于缺血對照組（P＜0.05），而Caspase-3陽性細胞表達數(shù)目則低于缺血對照組（P＜0.05）。結(jié)論 依達拉奉對大鼠缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，可能與增加Bcl-2的表達，減少Caspase-3的表達有關(guān)。

腦缺血再灌注；依達拉奉；細胞凋亡；Bcl-2；Caspase-3

溶栓是目前治療急性缺血性卒中最有效的方法，但僅有少數(shù)患者獲益，主要原因是溶栓時間窗狹窄，另外溶栓后出血轉(zhuǎn)化率增高和再灌注損傷也是其不可忽視的不良反應(yīng)[1]。因此長期以來一直在尋找有效保護措施來解決溶栓后的缺血再灌注損傷，而依達拉奉是一種自由基清除劑，抑制脂質(zhì)過氧化，減少炎性介質(zhì)從而有保護腦組織的作用[2]。本實驗采用大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）致局灶性腦缺血模型，觀察依達拉奉對大鼠腦缺血后梗死體積和神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-3表達的影響，從分子水平上探討依達拉奉對腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及給藥

選取雄性SD系大鼠72只，體質(zhì)量150～250 g（購自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心），隨機將大鼠分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、依達拉奉治療組，每組24只。假手術(shù)組（S組 n=24）手術(shù)僅暴露雙側(cè)CCA不結(jié)扎，30 min后縫合頸部切口，同時尾靜脈給藥，給予生理鹽水0.5 mL/kg，每日2次；缺血再灌注組（IR組，n=24）：采用Longa線栓法制備大鼠MCAO模型[3]，缺血2 h后再灌注，同時尾靜脈給藥，給予生理鹽水0.5 mL/kg，每日2次；依達拉奉治療組（P組，n=24）：采用Longa線栓法制備大鼠MCAO模型[3]，缺血2 h后再灌注，同時尾靜脈給藥，給予依達拉奉1 mg/kg，每日2次，依達拉奉由南京先聲藥業(yè)有限公司提供。各組又隨機分為缺血再灌注后2、24、72 h三個時間點亞組，每亞組動物8只（n=8），共9組。

1.2 動物模型的制作

參照Longa等[3]的大腦中動脈閉塞（MCAO）線栓法略做改進。以20%烏拉坦（5 mL/kg）腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠仰臥位固定，消毒皮膚，鋪無菌洞巾，頸正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總動脈（CCA）結(jié)扎同側(cè)CCA近心端和頸外動脈（ECA）分叉處，距CCA末端約5 mm處剪口，將直徑0.2 mm尼龍線沿頸內(nèi)動脈（ICA）方向插入，所用栓線為直徑0.2 mm尼龍漁線，頭段燒圓，頂端直徑約0.25～0.28 mm。術(shù)后縫合傷口，深度由分叉部計算約（18.5±0.5）mm，感覺有阻力即達大腦中脈起始部，完全阻斷其血流，于ICA近心端結(jié)扎該動脈，全層縫合切口，再灌注時抽出尼龍線1 cm，于腦缺血手術(shù)2h后再灌注，即造成缺血再灌注模型。術(shù)中室溫在（26±0.5） ℃，實驗中保持大鼠體溫（37 ±0.5） ℃，大鼠MCAO模型的神經(jīng)功能評分采用Zea Lon-ga評分法，0分：無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失癥狀，活動正常者；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪者；2分：出現(xiàn)左側(cè)Horner征，爬行時出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈者；3分：行走時身體向右側(cè)偏癱側(cè)傾倒者；4分：不能自發(fā)行走者，意識喪失者。評分為0分和4分者均被剔除，隨機補充，保證每小組8只不變。

1.3 標本采取和組織切片制備

SD大鼠腦缺血再灌注后第2、24、72 h，大鼠深度麻醉后，開胸，從左心室先快速灌注37 ℃生理鹽水100 mL，再灌注4%多聚甲醛100 mL，處死斷頭后迅速取腦，置于4%多聚甲醛液中固定4 h，然后放入30%蔗糖中，4 ℃冰箱過夜至組織塊沉底。將組織塊取出放入-20 ℃恒溫冰凍切片機中從視交叉前緣向后做連續(xù)切片，片厚7 μm。取相同層面切片分別做HE染色和免疫組織化學(xué)染色。免疫組化采用SP法，DAB顯色。所用抗Bcl-2；Caspase-3的濃度均為1∶400，由Santa Cruze公司提供；SP即用型工作試劑盒由北京中山生物公司提供。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0版軟件進行單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較用q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色

假手術(shù)組各區(qū)腦組織染色均勻，組織結(jié)構(gòu)致密清晰，神經(jīng)細胞呈錐體狀顆粒狀及不規(guī)則形，細胞排練整齊，胞體較大，核仁明顯。缺血再灌注組2 h病灶腦組織結(jié)構(gòu)紊亂，HE染色不均，深淺不一，神經(jīng)元細胞減少、皺縮、核染色濃縮；細胞間隙增寬，胞體變形，胞質(zhì)呈嗜酸性，染色較淡。病灶中心區(qū)出現(xiàn)大量神經(jīng)細胞壞死，周圍出現(xiàn)較多正常細胞和可逆性受損細胞，伴少量炎性細胞浸潤；再灌注后24 h對照組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)細胞壞死，缺血中心區(qū)大量神經(jīng)細胞壞死，范圍較2 h增大，病灶周邊區(qū)存在泡沫細胞，血管擴張及間質(zhì)水腫，也有較明顯的炎性細胞浸潤。依達拉奉各治療組與相應(yīng)缺血再灌注組對比，壞死面積明顯縮小，神經(jīng)細胞相對受損較輕。依達拉奉治療組對比缺血再灌注組有明顯治療效果。

2.2 Bcl-2免疫組織化學(xué)染色法使用SP法

Bcl-2陽性細胞為棕黃色細胞。每片選取10個有效視野，分別為紋狀體區(qū)5個，大腦皮質(zhì)5個，分別計數(shù)視野內(nèi)的棕黃細胞數(shù)，取其平均值為有效計數(shù)。缺血再灌注后2 h在皮質(zhì)和基底節(jié)區(qū)可觀察到Bcl-2陽性細胞分布均勻，缺血再灌注后24 h棕黃色數(shù)量減少，缺血再灌注后72 h數(shù)量明顯減少。對比治療組與再灌注組，Bcl-2陽性細胞數(shù)在相對應(yīng)的時間點表達明顯增多，有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 缺血再灌注2 h，24 h，72 h Bcl-2陽性細胞數(shù)比較（，n=8）

表1 缺血再灌注2 h，24 h，72 h Bcl-2陽性細胞數(shù)比較（，n=8）

注：與假手術(shù)組對比P*＜0.05與缺血再灌注組對比P#＜0.05

分組 再灌注2 h 再灌注24 h 再灌注72 h假手術(shù)組 21±1 7±4 8±1缺血再灌注組 30±2* 21±2* 28±5*依達拉奉組 49±6# 38±7# 48±5#

2.3 Caspase-3免疫組織化學(xué)染色同上述的計數(shù)方法

缺血再灌注后2 h，在基底節(jié)和皮質(zhì)區(qū)，可觀察到僅有少量散在的Caspase-3陽性細胞存在，缺血再灌注后24 h在上述區(qū)域可觀察到Caspase-3陽性細胞顯著增多，缺血再灌注72 h后Caspase-3陽性細胞增加更多。在相對應(yīng)時間點，對比依達拉奉治療組與缺血再灌注組，Caspase-3陽性細胞數(shù)表達明顯減少，有統(tǒng)計學(xué)意義。提示依達拉奉有抑制促凋亡蛋白Caspase-3的作用（表2）。

表2 缺血再灌注2 h，24 h，72 h Caspase-3陽性細胞數(shù)比較（，n=8）

表2 缺血再灌注2 h，24 h，72 h Caspase-3陽性細胞數(shù)比較（，n=8）

注：與假手術(shù)組對比P*＜0.05與缺血再灌注組對比P#＜0.05

分組 再灌注組2 h 再灌注24 h 再灌注72 h假手術(shù)組 28±2 66±12 55±8缺血再灌注組 14±5* 48±6* 35±5*依達拉奉組 6±2# 27±4# 18±3#

3 討 論

腦卒中是全球第二大最常見的死亡和致殘原因，在中國已成為首位死因，其中缺血性腦卒中占全部腦卒中患者的60%～80%，如何有效治療溶栓后缺血再灌注損傷是一個不容忽視的課題[4]。有研究表明缺血明再灌注后神經(jīng)細胞死亡主要有壞死和凋亡兩種形式，分別涉及主動和被動細胞死亡機制。缺血再灌注后神經(jīng)細胞死亡是一個比較復(fù)雜的病理過程，在急性期，病灶中心區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元皺縮、壞死，神經(jīng)元壞死與凋亡并存，以壞死為主。壞死區(qū)周邊的區(qū)域叫半暗帶區(qū)，半暗帶區(qū)神經(jīng)元要經(jīng)過1～2 d潛伏期才出現(xiàn)凋亡，提示細胞凋亡是缺血半暗帶細胞死亡的主要方式，呈進行性死亡，最終凋亡可能決定了梗死體積[5]。自1988年以來，有關(guān)凋亡基因和蛋白的研究也越來深入，有大量的動物實驗證實細胞凋亡存在于缺血性神經(jīng)元損傷過程后。其中，有關(guān)Bcl-2家族蛋白的研究較多，Bcl-2家族作為細胞凋亡的調(diào)控因子，在神經(jīng)細胞凋亡線粒體途徑中起重要的調(diào)節(jié)功能[8]。在細胞內(nèi)外的各種促發(fā)因子的作用下，引起細胞內(nèi)Bcl-2家族表達的變化或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，通過對線粒體外膜通透性的調(diào)控，引起膜間隙凋亡蛋白釋放。形成蛋白性孔道，或引起線粒體膜勢能的改變，通透性增加，促凋亡物質(zhì)釋放；甚至某些Bcl-2家族成員還可能調(diào)節(jié)線粒體膜的脂質(zhì)組分及其對其他家族成員在線粒體膜上形成孔道的能力，調(diào)控凋亡。Bcl-2是重要的抑制神經(jīng)細胞凋亡的蛋白，在腦缺血后2～4 h Bcl-2開始表達，隨著缺血壞死的加重24 h后表達明顯減少。Isenmann等研究發(fā)現(xiàn)，在局灶性缺血模型中Bcl-2在缺血半暗帶區(qū)存活的神經(jīng)細胞中表達明顯。Caspase是一些半胱氨酸蛋白酶家族，是哺乳動物細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，其參與了局灶性腦缺血后神經(jīng)細胞損傷的病理過程，在細胞凋亡過程中，起著關(guān)鍵性的作用[6,9,10]。內(nèi)源性細胞凋亡途徑始于線粒體，細胞色素C從線粒體內(nèi)釋放是關(guān)鍵的一步。細胞色素C在dATP存在條件下，與凋亡細胞酶激活因子Apaf-1結(jié)合，并激活Caspase9，就能次序的激活其下游的Caspase2、3、6、7、8、10，形成Caspase級聯(lián)反應(yīng)，將凋亡信號一級級傳至凋亡底物，引起細胞凋亡。Caspase-3被認為是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[7,9,10]。研究表明缺血后2～8 h有Caspase-3的表達，隨著缺血壞死的加重其表達明顯增加，24h時達高峰。本研究結(jié)果表明，在再灌注2、24、72 h依達拉奉治療組對腦缺血有保護作用。依達拉奉治療組與對照組在對應(yīng)時間點相比，Bcl-2表達增多，Caspase-3表達減少，說明依達拉奉對腦細胞凋亡有抑制作用。HE染色也顯示依達拉奉能明顯保護缺血半暗帶。本實驗研究結(jié)果為臨床缺血性腦卒中的治療提供了實驗室依據(jù)。

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Effects of Edaravone on Bcl-2 and Caspase-3 Expression Related to Neurons Apoptosis after Local Cerebral Ischemia Reperfusion

PAN Deng1, TAN Jun2
(1 Department of Neurology, Xinxiang First People’s Hospital, Xinxiang 453000, China; 2 Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)

Objective To investigate the effects of Edaravone on the expression of Bcl-2 and Caspase-3 of apoptosis of neurons after local cerebral ischemia reperfusion.Methods SD rats were randomly divided into shame operation group, control group and Edaravone group (n=24). The middle cerebal artery of rats was occluded for 2h by inserting an intraluminal filament, and reperfusion was then performed for 2, 24,72 h(n=4). The brains were embedded onto slides with paraffin for morphological assessment and immunhistochemistry was carried out to investigate the changes in Bcl-2 and Caspase-3. Results The expressions of Bcl-2 in all Edaravone groups at different times increased than each of the control groups and the expressions of cpspase-3 decreased in all Edaravone groups at different time than each of the control groups. Conclusion Edaravone is effective on cerebral ischemia reperfusion injury,the protective effect is perherps related to increase the expression of Bcl-2 and decrease the expression of Caspase-3.

Cerebral ischemia reperfusion; Edaravone; Apoptosis; Bcl-2; Caspase-3

R743

：B

：1671-8194（2014）05-0024-02