外界刺激對內源性生長因子TGF-β1的影響

顧令婉 周 莉 張 睿 李昱良 王 凱*

（遵義醫學院附屬口腔醫院，貴州 遵義 563003）

外界刺激對內源性生長因子TGF-β1的影響

顧令婉 周 莉 張 睿 李昱良 王 凱*

（遵義醫學院附屬口腔醫院，貴州 遵義 563003）

目的 觀察備洞對家犬牙髓中TGF-β1表達的影響及修復性牙本質的形成情況，探討牙本質牙髓復合體原位形成和內源性生長因子的相關性。方法 6只健康家犬，分別選取四顆磨牙，隨機分為1、2、3、4四個組，每組6顆牙；1組不予任何處理，作為對照組，2、3、4組為實驗組，分別給予長3 mm，寬3 mm，洞深2、2.5、3 mm的備洞刺激，予氧化鋅丁香油粘固劑暫封窩洞，分別于2、4、6 周麻醉下拔除，制作病理切片，顯微鏡下觀察修復性牙本質的形成情況，圖像分析和免疫組化方法觀察轉化生長因子-β1的表達。結果 在2.5 mm洞深刺激強度下，2 周時，每組都沒有修復性牙本質形成；3 mm洞深刺激強度，4、6周時，前期牙本質增寬，成牙本質細胞空泡變性，有第三期牙本質形成；每組都有轉化生長因子-β1表達，結果表明：隨著刺激度強和時間增加，呈表達增強趨勢（P＜0.05）。結論 備洞刺激可能激活了內源性轉化生長因子-β1，且可能參與了牙本質牙髓復合體的形成，內源性轉化生長因子-β1的誘導表達與時間和刺激強度成正相關關系。

修復性牙本質；牙本質牙髓復合體；轉化生長因子-β1

牙本質牙髓復合體構成了牙齒的主體，是高度特化的組織器官。窩洞制備、牙體預備、損傷、炎癥、齲蝕等外界刺激因素均可給牙髓健康造成危害，誘導和加強牙本質牙髓復合體的原位形成，保護牙髓健康是牙髓生物學近年研究的熱點。本文觀察了家犬牙齒在不同強度刺激下，內源性生長因子轉化生長因子-β1在牙髓中的表達情況和第三期牙本質形成情況，對內源性生長因子與牙本質牙髓復合體形成的相關關系進行探討，期望為研究牙本質牙髓復合體的誘導形成提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

12～24個月齡家犬，每只分別選取四顆磨牙為實驗對象，要求無明顯磨耗、牙周、牙體健康。

1.2 實驗器材

二步法免疫組化檢測試劑（批號：K106629B）、濃縮型DAB試劑盒（批號：753223A）、TGF-β1兔抗體（Santa Cruz Biotechonlogy，Inc批號：K0410）（均購自北京中衫金橋生物技術公司）；高速渦輪機、光學顯微鏡等。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組：6只家犬，每只分別選取四顆磨牙，隨機分為1、2、3、4四組，每組6顆牙；1組不作任何處理，作為對照組；2、3、4組作為實驗組，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg經腹腔注射麻醉下，分別制備長3 mm，寬3 mm，洞深2、2.5、3 mm的窩洞，為外界刺激方式，立即給予丁氧膏封閉窩洞。為防止丁氧膏脫落，實驗過程中均為軟食喂養。

1.3.2 標本采集和處理：各組在完成實驗后第2、4、6周，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg經腹腔注射麻醉下拔出實驗牙，每次2只，10%中性甲醛鹽溶液固定標本72 h，沿長軸將牙劈開，將牙髓組織完整取出，用5%硝酸浸泡牙體硬組織脫鈣至軟，常規制備組織切片，硬組織切片作HE染色，軟組織切片作免疫組化染色。

1.3.3 結果觀察及統計學處理：牙體硬組織中修復性牙本質的形成在光學顯微鏡下觀察；通過Image-Pro Plus 6.0計算機圖像分析系統分析免疫組化染色結果，陽性信號為胞質和包膜出現黃色著色，棕黃色為強陽性，黃色為陽性，淺黃色為弱陽性，未染色為陰性。在免疫組化照片上按相同面積截取對成牙本質細胞層進行光密度值分析，黃色部分的IOD值表示該蛋白的表達水平，數據用統計軟件SPSS13.0進行統計分析。所有數據均用（）表示。采用單因素方差分析對多組之間進行比較，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結 果

2.1 HE染色結果

在2.5 mm制洞強度刺激下，2周時，每組都無修復性牙本質形成，在3 mm 制洞強度刺激下，4、6周時，有修復性牙本質形成，前期牙本質增寬，成牙本質細胞呈空泡變性，修復性牙本質與原發性牙本質之間有深色分隔條帶（圖1、2、3）。

2.2 免疫組化染色結果

2.2.1 鏡下觀察結果：轉化生長因子-β1在各組牙髓組織中均有表達，1組和2組成牙本質細胞胞質和包膜染色呈淺黃色，表達呈弱陽性；3組和4組成牙本質細胞胞質和包膜染色呈黃色，表達呈陽性，其中4組在4周后染色呈棕黃色，表達呈強陽性；隨時間和刺激強度增加，轉化生長因子-β1表達逐漸增強（圖4、5）。

2.2.2 圖像分析結果：不同刺激強度和不同時間組經圖像分析和比較:1、2組轉化生長因子-β1的表達差異無顯著性（P＞0.05）；1、3組，1、4組轉化生長因子-β1表達差異有顯著性（P＜0.05）；2、3、4組轉化生長因子-β1的表達有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討 論

牙本質牙髓復合體的原位形成包括了反應性牙本質和修復性牙本質。修復性牙本質也叫刺激性牙本質，是在比較強的刺激下形成的，特點是有管間牙本質的形成，牙本質小管數目減少。備洞等外界因素導致牙本質暴露及成牙本質細胞發生變性，由年輕成纖維細胞分化而來的成牙本質細胞或鄰近的成牙本質細胞代替變性細胞在損害區形成牙本質，使得牙髓組織得以保護，免受不良刺激[1]。

圖1 2周2.5 mm HE×40

圖2 4周3 mm HE×40

圖3 6周3 mm HE×40

圖4 2周對照 HE×40

圖5 2周2mm HE×40

研究表明：刺激性牙本質的形成依靠前體細胞分化為成牙本質細胞，而成牙本質細胞的合成和分泌活性增強有利于反應性牙本質的形成，因此，成牙本質細胞的分化和增殖是牙本質牙髓復合體形成的重要環節。TGF-β在多種組織細胞的分化增殖、組織損傷修復、骨質再實驗雖然觀察到TGF-β1的表達隨時間和刺激強度的增加而增加，修復性牙本質的形成也與時間和刺激強度有關，但TGF-β1的表達在促進修復性牙本質形成的機制還不清楚；同時牙髓牙本質復合體能夠承受刺激的最大閾值未見相關報道，當牙髓牙本質復合體失去修復能力時能否通過誘導TGF-β1的表達而增強其修復能力仍然需要進一步探索。

[1] 樊明文,周學東.牙體牙髓病學[M].北京:人民衛生出版社,2008.

[2] Smith AJ,Cassidy N,Perry H,et al.Reactionary dentinogenesis[J]. Int J Dev Biol,1995,39(1):273-280.

[3] Tziafas D,Papadimitriou S.Role of exogenous TGF-β in inductin of reparative denntinogenesis in vivo[J].Eur J Oral Sci,1998,106 (Suppl l):192.

[4] Smith AJ,Cassidy N,Perry H,et al.Reactionary dentinogenesis[J]. Int J Dev Biol,1995,39(1):273-280.

[5] 張倩,程祥榮,何俐,等.全冠牙體預備后影響牙髓-牙本質復合體反應因素的研究[J].武漢大學學報,2005,26(3):355-358.生、間質形成，以及胚胎發育中起著重要作用[2]。不僅對成牙本質細胞層的生物合成活性有增強刺激的效應，而且可使牙髓細胞發生增殖分化和遷移，對牙髓成纖維細胞具有強趨化作用。攜帶主要信息參與成牙本質細胞的分化，參與間充質與上皮間的信號傳遞，作為一種信號分子可能參與了成牙本質細胞的分化啟動過程[3,4]。

實驗采用的外界刺激因素為制備窩洞，觀察了不同深度的制洞刺激下，內源性轉化生長因子-β1在牙髓組織中的表達水平和刺激性牙本質形成情況，結果表明：2.5 mm刺激強度下，2周以前，每組都沒有修復性牙本質形成，3 mm刺激強度下，4、6周時，有修復性牙本質形成前期牙本質增寬，成牙本質細胞發生空泡變性，修復性牙本質與原發性牙本質之間有深色分隔條帶；各組牙髓組織中均有TGF-β1表達，且表達水平隨刺激強度和時間呈增強趨勢。但當刺激時間和刺激強度達到一定的程度，牙髓組織的修復能力不足以承受時，牙髓組織可能出現炎性反應，甚至牙髓壞死。張倩[5]等研究認為：當剩余牙本質厚度＜2.5 mm時，隨著時間的增加，牙髓即可產生防御反應，6周左右能觀察到刺激性牙本質形成，故本實驗觀察的最長時間為6周。

R78

：B

：1671-8194（2014）05-0055-02

貴州省衛生廳青年科技基金項目

*通訊作者：E-mail:297756834@qq.com