人體淋巴母細胞建株方法的改進研究

熊樂琴 馬昌杯 李善妮 帥云飛

隨著人類社會的發展, 遺傳多樣性的保存顯得尤為重要,對于全球性生物多樣性研究具有重大意義。人類突變細胞是研究人類生物學特征的重要資源, 也是在細胞水平上開展遺傳病研究的寶貴材料。在傳統的淋巴母細胞建株方法的基礎上, 作者于2012年1月～2013年12月對此進行了改進, 效果明顯, 建株時間在18 d左右, 且成功率保持在95%以上,有效提高了淋巴母細胞建株的成功率, 縮短了建株時間, 操作簡便, 為人類突變細胞的收集、保存以及遺傳資源的保存創造了有利條件, 值得推廣應用。

1 材料與方法

1.1 材料 1640培養基(pH7.2±0.1)、谷氨酰胺(glutamine)、血清、環孢霉素(Ciclosporin)、淋巴細胞分離液(lymphocyte isolation)、EB病毒。

1.2 EB病毒的制備 方法一：選取B95-8細胞, 用前1天內進行換液, 并反復凍融2～3次, 將收集的上清液進行過濾,4～5℃保存。方法二：運用傳統方法對EB病毒進行制備,-70℃保存。

1.3 人類淋巴母細胞建株 取外周血4～5 ml, 與2～3 ml 1640培養基(pH 7.2±0.1)在離心管中進行混合, 并將混合液注入置含有2～3 ml淋巴細胞分離液的離心管中, 待靜置1 min后,離心后分離淋巴細胞, 洗滌3次, 注入培養液(1 mmol/L谷氨酰胺, 25%血清) 6 ml, 隨機平均分為6份, 共3組。①、②組加入0.5 ml血清以及方法一制備的EB病毒1 ml, ③組加入傳統方法制備的EB病毒1 ml；每份加入適量環孢霉素, 輕輕混勻。①組、②組采取36℃開放式培養, 2 d后半量換液,并加入適量環孢霉素和EB病毒, 保持環孢霉素的濃度, 此后每隔3 d進行換液；7 d后對①組標本行活細胞分離, 待細胞數達到目標范圍后進行細胞核型分析以及凍存。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行數據的統計學分析, 成功率比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 69例淋巴母細胞標本建株情況 對比分析三組淋巴母細胞建株的成功率, 其中①組的建株成功率最高, 為91.3%；③組成功率最低, 為39.1%, 詳見表1。

表1 各組淋巴母細胞建株成功率比較(n, %)

2.2 淋巴母細胞的生長狀況 ①組、②組3 d后可發現大量細胞生長迅速, 少量細胞死亡；5 d后可發現大量細胞呈團塊狀, 團塊表面存在黑色顆粒, 折光度減小, 中間存在少量活細胞；7 d后現象更為明顯。①組經活細胞分離后, 細胞的生長速度加快, 而②組則生長緩慢；③組在4～6 d后可發現部分細胞粘于瓶壁, 有少量懸浮的細胞團塊, 折光度低,存在大量的死細胞, 細胞生長緩慢。

3 討論

EB病毒可以選擇性地將B淋巴細胞進行轉化, 環孢霉素可以在細胞的G0、G1期選擇性抑制T淋巴細胞中的RNA聚合酶Ⅱ的活性, 從而有效阻斷T細胞的繁殖, 避免已經轉化的B淋巴細胞由于T淋巴細胞的介入而導致退化［1］。采用方法一制備EB病毒是當B95-8細胞達到平臺期后采集EB病毒, 由于此時的B95-8細胞能釋放出大量的EB病毒,因此感染力強, 效果明顯；采用方法二制備EB病毒, 并將其置于-70℃儲存, 大量的EB病毒會失去自身的感染力, 在開始階段, 難以轉化成B淋巴細胞, 效果較差［2］。2 d后, 由于經EB病毒感染后的T淋巴細胞大部分仍然具有應答反應,另有一些T淋巴細胞未受到環孢霉素的干擾, 因此, 需往培養液中添加適量的環孢霉素以及EB病毒。培養5d后, 由于大部分B淋巴細胞轉化充分, 且T淋巴細胞由于受到環孢霉素的干擾逐漸退化, 甚至死亡, 并釋放出多種酶以及大量的細胞碎片, 這些酶以及細胞碎片一定程度上會影響B淋巴細胞的增殖, 甚至導致已經轉化的B淋巴細胞退化、凋亡。將建株成功的標本靜置培養1周, 可在試管底部的沉降細胞周圍發現生長暈, 進行半量換液后, 9～11 d轉瓶, 顯微鏡可觀察到胞質突出、聚集成團、形態各異的細胞株, 此后4～6 d傳代一次, 經過5～6次傳代后可使細胞懸液達到60 ml左右,即可凍存。此次研究表明, ①組加入的淋巴細胞分離液可以促進淋巴細胞的進一步分離, 去除有害物質以及壞死細胞,從而加快了B淋巴細胞的生長速度, 提高了淋巴母細胞的建筑成功率, 縮短了建株時間, 其效果要明顯好于②組、③組。

［1］ 陳寶安, 馬金龍, 劉苒, 等.bcr-abl融合基因陽性慢性髓系白血病繼發髓外T淋巴母細胞病變一例報告附文獻復習.中華血液學雜志, 2011, 32(10): 693-694.

［2］ 莫小輝, 宋寧靜, 陳佳, 等.EBV轉化帶狀皰疹患者外周血B淋巴母細胞系的建立.免疫學雜志, 2013, 29(7): 615-618.