不同培養基對人臍帶間充質干細胞生物學特性的影響

白尚星

【摘要】目的觀察不同培養基對人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)生物學特性的影響, 優化培養方法。方法采用貼壁法從正常足月胎兒臍帶中分離出間充質干細胞, 細胞貼壁后利用DMEM/F12, Mesen PRORSTM Medium這兩種培養體系進行體外擴增, 繪制生長曲線, 流式細胞儀檢測其表面標志。結果從人臍帶中分離出的間充質干細胞為梭形, 呈平行排列生長或漩渦狀生長；細胞表達CD29、CD44, 不表達CD34、CD45和HLA-DR。結論加入Mesen PRORSTM Medium培養的細胞增殖速度快, 更適合于臍帶間充質干細胞的體外擴增。

【關鍵詞】間充質干細胞；臍帶；生物學特性

Influence of different mediums on biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cellBAI Shang-xing.Shenyang Sixth People's Hospital, Shenyang 110000, China

【Abstract】Objective?To investigate the differences of biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) in different mediums, and to optimize the purify methods. Methods?Mesenchymal stem cells were separated from healthy full-termed delivery fetus using tissue-adherent culture method. These cells were cultured and amplified in DMEM/F12 and Mesen PRORSTM Medium in vitro. The growth curve was drawn.Their surface markers were detected by flow cytometry. Results?Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord were spindle-shaped adherent cells.They have strong proliferation ability. The results of growth curve showed that compared with two medium, hUC-MSCs in Mesen PRORSTM Medium grew quickly at every time point. They were strongly positive expression for CD44 and CD29, but negative expression for CD34, CD45 and HLA-DR. Conclusion?Cell doubling time in the Mesen PRORSTM Medium was shorter than in DMEM/F12.

【Key words】Mesenchymal stem cell; Umbilical cord; Biological charateristics間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)來源于發育早期的中胚層, 是具有高度自我更新能力, 高度增殖能力和多向分化潛能的多能干細胞［1, 2］, 廣泛存在于骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織中［3］。臍帶為分娩廢棄物, MSC含量豐富, 無需有創穿刺即可獲得, 且較骨髓來源的MSC擴增能力更強, 成為近年來MSC研究的重要來源之一［4］。本研究采用兩種不同培養基培養hUC-MSCs, 并對其進行生物學特性的觀察、細胞免疫表型的鑒定, 以期建立一種穩定、高效、快速、經濟的hUC-MSCs富集方法, 為臨床細胞移植提供實驗支持。

1材料

1. 1臍帶選擇足月胎兒的臍帶, 產婦身體健康, 肝功能正常, 無傳染性疾病, 簽署知情同意書。臍帶4℃無菌保存, 4 h內完成實驗操作。

1. 2主要試劑DMEM/F12, Mesen PRORSTM Medium和胰蛋白酶購自GibCO；胎牛血清(FBS)購自HyClone；鼠抗人抗體CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC購自BD。

2方法

2. 1人臍帶MSCs 的分離、培養及擴增?臍帶剪成3~5 cm小段取出臍帶放入培養皿中, 用0.9%氯化鈉注射液沖洗, 洗盡血液。用手術剪剔除血管和外膜, 剪成2~3 mm小塊, 用0.9%氯化鈉注射液清洗一次, 用DMEM/F12培養基清洗一次, 分成兩組：A組加入培養基(含50%Mesen PRORSTM Medium, 48% DMEM/F12和2%胎牛血清), B組加入培養基(DMEM/F12含 10%胎牛血清)放入250 ml培養瓶中, 組織塊密度要適中, 每瓶20 ml, 放置于37℃, 體積分數5%CO2, 飽和濕度培養箱內培養。倒置顯微鏡下觀察, 有少量成纖維狀細胞貼壁生長, 倒掉培養基和組織塊。添加培養基繼續培養, 每3天換液, 細胞生長達80%以上時, 用胰酶消化, 按1：3傳代。

2. 2細胞生長曲線制作取生長良好的3代細胞, 按2×104/ml濃度接種24孔板, 每孔1 ml, 3 d換液一次, 以第2 d起每隔24小時計數3個孔細胞數, 取其平均值, 繪制7 d的生長曲線。

2. 3hUC-MSCs表面標記的檢測取3代細胞, 用0.25%胰酶消化, 用PBS洗滌2次, 制成l×106的細胞懸液, 每管加入100 μl, 設置陰性對照, 加入IgG1-FITC, 其它管加入20 μl鼠抗人HLA-DR-FITC、CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC, 室溫避光孵育30 min, 流式細胞儀計數5000~10000個細胞。

3結果

3. 1hUC-MSCs的分離、培養和純化兩組培養基原代臍帶間充質干細胞接種6~7 d, 除去組織塊, 倒置顯微鏡下可見有少量纖維狀的貼壁細胞, 2 d后形成散在的細胞集落, 大部分是長梭形的成纖維樣細胞, 細胞折光性好, 14~18 d細胞集落增多, 細胞融合80%以上。(見圖lA-B)用0.25%胰酶消化傳代, 3代后可得到較為純化的間充質干細胞, 傳代后的細胞增殖速度快, 約3~4 d可傳代1次。傳代后細胞形態較原代均一, 以平行排列生長或漩渦狀生長。兩組培養基培養的間充質細胞形態相似, 無明顯差別。A組貼壁細胞較多, 細胞生長較快。

圖1人臍帶MSCs ( 倒置顯微鏡下) 的形態特征

3. 2hUC-MSCs生長曲線?傳代后的細胞第1~2天處于滯留期, 無明顯增殖。第3~5天進入對數生長期, 細胞增殖加速達到高峰, 第6~7天進入平臺期, A組細胞增殖快于B組細胞(見圖2)。

圖2人臍帶MSCs 的生長曲線

3. 3hUC-MSCs的表面標志流式細胞儀檢測結果表明, hUC-MSCs不表達造血細胞表面抗原標志CD34、CD45, 強表達CD29和CD44, 不表達HLA-DR, 表明本實驗分離的細胞符合間充質干細胞的表面標志；兩組培養基抗原表達無顯著差異。見表1。

表1hUC-MSCs的表面抗原(%)

組別 CD29 CD44 CD45 CD34 HLA-DR

A組 0.98 0.94 0.04 0.15 0.31

B組 0.95 0.93 0.03 0.18 0.29

4討論

間充質干細胞廣泛存在于骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織中, 其中尤以臍帶間充質干細胞更為原始, 分化能力和增殖能力強, 且其來源于胚胎組織, 免疫原性更低［5］。臍帶中有2條動脈和1條靜脈, 包繞動靜脈的黏蛋白樣結締組織即為華通氏膠(Warthons jelly)。目前可從臍帶靜脈內皮、內皮下層、Warthons jelly、血管周圍組織以及羊膜來源的上皮組織等中分離得到MSCs ［6］。臍帶來源廣泛, 采集方便, 免疫排斥小, 倫理爭議小等優點, 使其成為干細胞研究熱點, 在細胞治療中前景越來越廣闊。本實驗成功從人臍帶中分離出間充質干細胞, 獲得的原代細胞能夠連續傳代, 傳代后細胞純度提高, 形態較原代均一, 以平行排列生長為主, 或呈漩渦狀生長, 細胞能夠大量增殖, 經流式細胞儀檢測, hUC-MSCs不表達造血細胞標志CD34、CD45, 強表達CD29和CD44, 不表達HLA-DR說明其免疫原性極低, 符合間充質干細胞的特點。用于臍帶間充質干細胞體外培養的體系包括低糖DMEM、DMEM/F12和無血清培養體系。其中DMEM/F12是由DMEM培養基和F12培養基按1：1混合組成的, 其營養成分豐富, 可以使用較少血清, 或作為無血清培養基的基礎培養基, 適于原代細胞培養［7, 8］。Mesen PRORSTM Medium是一種無血清培養基, 適合于間充質干細胞的培養, 但其價格昂貴, 不利于大量使用。本實驗在DMEM/F12培養基基礎上加入適量的Mesen PRORSTM Medium培養細胞, 結果表明, 能夠大量增殖細胞并且縮短培養時間, 還可以減少血清的用量, 減少移植輸注給患者時產生的不良反應。因此, 無論從培養角度, 還是從臨床應用考慮, 培養細胞時適量加入Mesen PRORSTM Medium都是較好的培養方式。

參考文獻

［1］ Caimi PF, Reese J, Lee Z, et al. Emerging therapeutic approaches for multipotent mesenehymal stromal cells. Curr Opin Hematol, 2010, 17(6):505-513.

［2］ Sun NZ, Ji H. In vitro diferentiation of osteocytes and adipocytes from human placenta-derived cels. J Int Med Res, 2012, 40(2):761-767.

［3］ Pendleton C, Li Q, Chesler DA, et al. Mesenchymal stem cell derived from adipose tissue vs bone marrow:in vitro comparison of their tropism towards gliomas. PLoS One, 2013, 8(3):58198.

［4］ Bongso A, Fong CY. The therapeutic potential, challenges and future clinical directions of stem cells from the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cell Rev, 2013, 9(2):226-240.

［5］ Baksh D, Yao R. Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage diferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived fro umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 2007, 25(6):1384-1392.

［6］ Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(12):1330-1337.

［7］ 洪敬欣, 張茜真, 韓俊領, 等.人臍帶間充質干細胞在3 種不同培養體系中的生長狀況及腺病毒感染效定.中國組織工程研究與臨床康復, 2010, 14(1):42-47.

［8］ 辛毅, 李娜, 黃益民, 等.人臍帶間充質干細胞的原代培養及多向分化潛能的研究. 細胞與分子免疫學雜志, 2013, 29(10): 1087-1093.

［收稿日期：2014-03-10］

圖2人臍帶MSCs 的生長曲線

3. 3hUC-MSCs的表面標志流式細胞儀檢測結果表明, hUC-MSCs不表達造血細胞表面抗原標志CD34、CD45, 強表達CD29和CD44, 不表達HLA-DR, 表明本實驗分離的細胞符合間充質干細胞的表面標志；兩組培養基抗原表達無顯著差異。見表1。

表1hUC-MSCs的表面抗原(%)

組別 CD29 CD44 CD45 CD34 HLA-DR

A組 0.98 0.94 0.04 0.15 0.31

B組 0.95 0.93 0.03 0.18 0.29

4討論

間充質干細胞廣泛存在于骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織中, 其中尤以臍帶間充質干細胞更為原始, 分化能力和增殖能力強, 且其來源于胚胎組織, 免疫原性更低［5］。臍帶中有2條動脈和1條靜脈, 包繞動靜脈的黏蛋白樣結締組織即為華通氏膠(Warthons jelly)。目前可從臍帶靜脈內皮、內皮下層、Warthons jelly、血管周圍組織以及羊膜來源的上皮組織等中分離得到MSCs ［6］。臍帶來源廣泛, 采集方便, 免疫排斥小, 倫理爭議小等優點, 使其成為干細胞研究熱點, 在細胞治療中前景越來越廣闊。本實驗成功從人臍帶中分離出間充質干細胞, 獲得的原代細胞能夠連續傳代, 傳代后細胞純度提高, 形態較原代均一, 以平行排列生長為主, 或呈漩渦狀生長, 細胞能夠大量增殖, 經流式細胞儀檢測, hUC-MSCs不表達造血細胞標志CD34、CD45, 強表達CD29和CD44, 不表達HLA-DR說明其免疫原性極低, 符合間充質干細胞的特點。用于臍帶間充質干細胞體外培養的體系包括低糖DMEM、DMEM/F12和無血清培養體系。其中DMEM/F12是由DMEM培養基和F12培養基按1：1混合組成的, 其營養成分豐富, 可以使用較少血清, 或作為無血清培養基的基礎培養基, 適于原代細胞培養［7, 8］。Mesen PRORSTM Medium是一種無血清培養基, 適合于間充質干細胞的培養, 但其價格昂貴, 不利于大量使用。本實驗在DMEM/F12培養基基礎上加入適量的Mesen PRORSTM Medium培養細胞, 結果表明, 能夠大量增殖細胞并且縮短培養時間, 還可以減少血清的用量, 減少移植輸注給患者時產生的不良反應。因此, 無論從培養角度, 還是從臨床應用考慮, 培養細胞時適量加入Mesen PRORSTM Medium都是較好的培養方式。

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［6］ Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(12):1330-1337.

［7］ 洪敬欣, 張茜真, 韓俊領, 等.人臍帶間充質干細胞在3 種不同培養體系中的生長狀況及腺病毒感染效定.中國組織工程研究與臨床康復, 2010, 14(1):42-47.

［8］ 辛毅, 李娜, 黃益民, 等.人臍帶間充質干細胞的原代培養及多向分化潛能的研究. 細胞與分子免疫學雜志, 2013, 29(10): 1087-1093.

［收稿日期：2014-03-10］

圖2人臍帶MSCs 的生長曲線

3. 3hUC-MSCs的表面標志流式細胞儀檢測結果表明, hUC-MSCs不表達造血細胞表面抗原標志CD34、CD45, 強表達CD29和CD44, 不表達HLA-DR, 表明本實驗分離的細胞符合間充質干細胞的表面標志；兩組培養基抗原表達無顯著差異。見表1。

表1hUC-MSCs的表面抗原(%)

組別 CD29 CD44 CD45 CD34 HLA-DR

A組 0.98 0.94 0.04 0.15 0.31

B組 0.95 0.93 0.03 0.18 0.29

4討論

間充質干細胞廣泛存在于骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織中, 其中尤以臍帶間充質干細胞更為原始, 分化能力和增殖能力強, 且其來源于胚胎組織, 免疫原性更低［5］。臍帶中有2條動脈和1條靜脈, 包繞動靜脈的黏蛋白樣結締組織即為華通氏膠(Warthons jelly)。目前可從臍帶靜脈內皮、內皮下層、Warthons jelly、血管周圍組織以及羊膜來源的上皮組織等中分離得到MSCs ［6］。臍帶來源廣泛, 采集方便, 免疫排斥小, 倫理爭議小等優點, 使其成為干細胞研究熱點, 在細胞治療中前景越來越廣闊。本實驗成功從人臍帶中分離出間充質干細胞, 獲得的原代細胞能夠連續傳代, 傳代后細胞純度提高, 形態較原代均一, 以平行排列生長為主, 或呈漩渦狀生長, 細胞能夠大量增殖, 經流式細胞儀檢測, hUC-MSCs不表達造血細胞標志CD34、CD45, 強表達CD29和CD44, 不表達HLA-DR說明其免疫原性極低, 符合間充質干細胞的特點。用于臍帶間充質干細胞體外培養的體系包括低糖DMEM、DMEM/F12和無血清培養體系。其中DMEM/F12是由DMEM培養基和F12培養基按1：1混合組成的, 其營養成分豐富, 可以使用較少血清, 或作為無血清培養基的基礎培養基, 適于原代細胞培養［7, 8］。Mesen PRORSTM Medium是一種無血清培養基, 適合于間充質干細胞的培養, 但其價格昂貴, 不利于大量使用。本實驗在DMEM/F12培養基基礎上加入適量的Mesen PRORSTM Medium培養細胞, 結果表明, 能夠大量增殖細胞并且縮短培養時間, 還可以減少血清的用量, 減少移植輸注給患者時產生的不良反應。因此, 無論從培養角度, 還是從臨床應用考慮, 培養細胞時適量加入Mesen PRORSTM Medium都是較好的培養方式。

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［4］ Bongso A, Fong CY. The therapeutic potential, challenges and future clinical directions of stem cells from the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cell Rev, 2013, 9(2):226-240.

［5］ Baksh D, Yao R. Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage diferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived fro umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 2007, 25(6):1384-1392.

［6］ Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(12):1330-1337.

［7］ 洪敬欣, 張茜真, 韓俊領, 等.人臍帶間充質干細胞在3 種不同培養體系中的生長狀況及腺病毒感染效定.中國組織工程研究與臨床康復, 2010, 14(1):42-47.

［8］ 辛毅, 李娜, 黃益民, 等.人臍帶間充質干細胞的原代培養及多向分化潛能的研究. 細胞與分子免疫學雜志, 2013, 29(10): 1087-1093.

［收稿日期：2014-03-10］