不同消化時間下膠原酶對人臍帶間充質干細胞分離的影響

郝世凱　蘇相相　洪敬欣

【摘 要】 目的：比較膠原酶的不同消化時間，觀察所獲得的間充質干細胞的數量，確定最為理想的消化時間。方法：分別采用3h、5h、7h的消化時間分離臍帶間充質干細胞；通過傳代進行純化和擴增培養，繪制生長曲線；用流式細胞儀檢測其表面標志。結果：分離出的間充質干細胞貼壁后為梭形，呈平行排列生長或漩渦狀生長，并且消化時間為5h時收獲到的細胞數量最多；流式細胞儀檢測結果顯示，獲得的間充質干細胞均表達CD73、CD105、HLA-ABC，不表達CD34、CD45、HLA-DR。結論：膠原酶消化法從人臍帶中分離培養的細胞具有間充質干細胞的生物學特性，并且消化5h收獲得的間充質干細胞數量最多，生長狀況最好。

【關鍵詞】 膠原酶；臍帶；間充質干細胞；分離；消化時間

【中圖分類號】R3292 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2014）24-0036-05

The impact of different collagenase digestion time on UCMSCs separation

HAO Shi-kai，SU Xiang-xiang，HONG Jing-xin

UNION STEMCELL&GENE ENGINEERING CO.LTD，Tianjin 300384，China

Abstract：Objective Comparing the quantity of MSCs acquired from umbilical cord that digested by collagenase II in different hours， ascertain an ideal digesting time and culture and appraise the cells acquired.Methods MSCs were isolated from human umbilical cord through collagenase digestion respectively in 3h， 5h， 7h， then passaged to purify and culture， drew the growth curve.Their surface markers and cells cycle were detected by flow cytometry.Results MSCs isolated from umbilical cord adhered with a spindle-shape， they parallel along their longitudinal axis or grew in whirl manner. After 5hours digestion， we got the biggest quantity with best growth status， and successfully built the method for MSCs culture and increasing. Detected by flow cytometry， all of adherent cells express CD73、CD105、HLA-ABC，none of them express CD34、CD45、HLA-DR.Conclusion Cells isolated from umbilical cord by digestion have the biological characteristics of MSCs. And 5 hours is the best time for digestion to acquire the most and best MSCs.

Keywords：Collagenase； Umbilical cord； Mesenchymal Stem Cells； Isolate； Digestion time

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種多潛能干細胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能，在人體生長、發育過程中存在于多種組織中。目前，MSCs主要來源于人骨髓，但成人骨髓中MSCs容易被病毒感染，且強的免疫原性等因素限制了其臨床應用[1]。此外骨髓來源的間充質干細胞還存在以下問題：隨著年齡的老化，干細胞數目顯著降低，增殖分化能力大幅度衰退；制備過程不容易質控；移植給異體可能引起免疫反應；取材時對患者有損傷，患者有骨髓疾病時不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。這都限制了骨髓間充質干細胞臨床應用，使得尋找骨髓以外其他可替代的間充質干細胞來源成為一個重要的問題[2]。

最近，在人的臍帶中也發現了間充質干細胞，因其來源豐富、易于獲得、不存在倫理問題，有望成為組織工程理想的種子細胞[3]。對UCMSC（臍帶干細胞）進行的體內研究結果很令人鼓舞，將其移植到重度肌肉損傷的小鼠模型中，供體細胞的蛋白質表達譜具有骨骼肌分化的特征，并能增強肌肉再生[4]。將UCMSC移植入小鼠缺血的大腦中能改善受體的神經功能，有證據表明供體細胞分化為神經元、神經膠質細胞和血管內皮細胞。這同體外培養時所體現的多潛能相一致，并且移植能促進血管形成和增加缺血損傷部位的血流，該研究表明移植UCMSC可以發揮多種臨床功效[5]。

目前，國際干細胞治療學會提出了鑒定人來源間充質干細胞的3條最低標準[6]：①在標準培養條件下，間充質干細胞具備對塑料底壁的貼附性；②間充質干細胞群體表達CD105、CD73及CD90，而不表達造血細胞標志物CD45和CD34；③經體外誘導，間充質干細胞能向成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞等分化。這僅僅是間充質干細胞的體外鑒定標準，一些研究者一直尋求間充質干細胞的體內鑒定[7]標準。

間充質干細胞在組織中的比例極低，因此，如何獲取高純度的間充質干細胞相當重要。目前最常用的分離間充質干細胞的方法有貼壁培養法、膠原酶法、胰酶-膠原酶法，一些實驗研究者通過組織塊培養法收獲的原代細胞產量比對應的酶消化法要多且成功率高，降低了培養的成本和難度，避免了培養中異種蛋白的混入，進而降低其臨床排斥反應[8]。

本研究從足月胎兒臍帶中分離出MSCs，通過比較不同消化時間對所收獲間充質干細胞的影響，并觀察和研究其形態學、生長特性、細胞周期及免疫表型。

1 材料和方法

11 主要儀器和試劑 離心機（Beckman Coulter X-15R），75T培養瓶（Corning Incorporated），倒置顯微鏡（OLYMPUS CKX41），孵箱（Thermo CO2孵箱3111），流式細胞儀（BD FACS Calibur），DMEM/F12、膠原酶Ⅱ、025%胰酶（GIBCO），PE標記的CD34、CD45、CD73、CD105、FITC標記的HLA-ABC、HLA-DR（BD Parmingen）。具體見表1。

12 人臍帶MSCs的分離、培養及擴增 無菌采集健康胎兒臍帶15根，各取15cm隨機分為15組，再將每組臍帶平均分為3等份，用加有雙抗的生理鹽水充分清洗，去除臍靜脈及動脈內的殘留血液，將其剪碎成1mm3的組織塊，移至質量體積分數為10%的膠原酶Ⅱ中，37℃分別消化3h、5h、7h，200目濾網過濾，收集含細胞的濾液，4℃、2000r/min離心5min，棄上清，保留沉淀，用DMEM/F12將細胞輕輕吹打成單細胞懸液，充分洗滌，4℃、300r/min離心5min，棄上清，保留細胞沉淀，用體積分數為12%FBS的DMEM/F12重懸，制成單細胞懸液，胎盼藍計數法計活細胞數后，接種于25T培養瓶中，置于37℃、體積分數5% CO2的飽和濕度孵箱內培養。5～6d后首次全量換液，去除未貼壁細胞，以后每隔3～4d換液1次。倒置顯微鏡下觀察細胞達85%以上融合后，用質量體積分數為025%的胰酶消化細胞，倒置顯微鏡下控制消化時間，按1∶[KG-*3/5]3的比例傳代，繼續擴增培養。

13 細胞生長活性測定 取第三代間充質干細胞，用025%胰酶消化后，以2×104/ml，接種于24孔板內，每隔24h消化3個孔，收集細胞，并用臺盼藍計數法計數，繪制生長曲線。

14 人臍帶MSCs的免疫表型鑒定 取第三代細胞，以025%胰酶消化后，用含12%FBS的DMEM/F12終止消化，4℃、250r/min離心5min，去上清，制成2ml懸液，分為每管10μl。陰性對照管分別加入IgG-FITC、IgG-PE，其他管分別加入CD73-PE、CD105-PE、HLA-ABC-FITC，CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-FITC，室溫避光孵育30min，流式細胞儀檢測。

15 主要觀察指標 ①不同消化時間收獲人臍帶間充質干細胞數量。②人臍帶間充質干細胞生物學特性。

16 設計、實施、評估者 設計、實施為第一作者，評估為第二作者，均經過系統培訓，未使用盲法評估。

2 結果

21 不同消化時間膠原酶Ⅱ對人臍帶間充質干細胞分離的影響 參考王娟等[9]在人臍帶間充質干細胞體外分離、純化及鑒定中的方法，通過比較臍帶的不同消化時間發現，所有標本中消化時間為3h 時，未獲得間充質干細胞；消化時長為7h時，僅有少量細胞貼壁，但培養后無細胞融合；消化時長為5h時，倒置顯微鏡下觀察有大量活性細胞存在，且具有較強的增殖能力，見表2。

22 人臍帶MSCs分離、擴增及形態觀察 本實驗通過對消化時長為5h的細胞培養觀察發現，細胞多于24h內開始貼壁，培養7d后，大部分細胞貼壁，細胞呈梭形、多角形，14d后細胞生長較快，于14～21d即可達到85%融合。傳代后細胞生長速度明顯加快，4～5d可傳代一次，傳代后細胞純度提高，形態為較為均一的梭形，以平行排列生長或旋渦狀生長。（圖1）

23 人臍帶MSCs的生長活性測定 取第3代細胞繪制生長曲線，從曲線上可以看出傳代后的細胞第1～2d處于滯留期，增殖不明顯。第3～5d進入對數生長期，細胞增殖加速，第6～7d進入平臺期（圖2）。

24 人臍帶MSCs的免疫表型分析 經流式細胞術檢測，通過膠原酶消化法所獲得的細胞均表達CD73、CD105、HLA-ABC，不表達CD34、CD45、HLA-DR，由此說明，從臍帶分離出來的貼壁細胞即為間充質干細胞（圖3）。

3 討論

臍帶內含兩條動脈和一條靜脈，血管的周圍環繞著半透明的基質，稱為華通膠。以往資料顯示，可從臍帶靜脈內皮、內皮下層、華通膠以及血管周圍組織等分離得到MSCs[10-14]。間充質干細胞（MSCs）具有自我復制、多向分化和免疫調控能力，在組織工程、基因工程和造血干細胞移植領域具有較好的應用前景。

骨髓是目前MSCs的主要來源[15]，本實驗結果顯示臍帶來源的MSC與骨髓MSC的形態特點相似，并有更強的增殖能力[16]。此外，研究還發現臍帶來源的MSC與骨髓來源的MSC表面抗原表達相近，表明該細胞體系中富含MSC。然而由于其細胞數量和增殖分化能力隨年齡增長而顯著下降，移植物不便在體外預先定制，異體移植中的倫理爭議以及病毒傳染等問題也限制了其臨床應用[17-18]。

有實驗證明在不同的誘導條件下，MSCs不僅可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和肌肉細胞等中胚層細胞，而且還可以跨胚層分化為外胚層的神經元、神經膠質細胞及內胚層的肝細胞等[19-23]。MSCs還對造血干細胞具有擴增作用，移植MSCs可以促進造血干細胞的植入[24-25]。

MSCs的分離方法有：①貼壁篩選法：依據MSCs易貼附在塑料培養物上生長的特性將其與非貼壁細胞分離；有學者直接使用貼壁篩選法，但標本中的大量紅細胞占據了MSCs所需的貼壁空間，影響MSCs的獲得率[26]；②酶消化法：用膠原酶對臍帶組織進行消化，所獲得的細胞進行貼壁培養、擴增；③單細胞克隆的方法[27]分離MSCs：實驗條件要求高，所需標本量大。目前已經有學者[28]采用了將密度梯度離心法與貼壁相結合的方式進行分離，并獲得了很好的效果。本研究采用膠原酶Ⅱ消化法，通過比較不同的消化時間，從足月胎兒臍帶中分離、擴增出MSCs，并發現5h為最佳消化時間。從形態學研究發現，體外培養MSCs，傳3～4代后細胞形態均一，貼壁后呈平行排列生長或旋渦狀生長。通過研究MSCs生長曲線圖發現，貼壁培養3～5d細胞處于對數生長期，細胞增殖速度快。對細胞生長周期研究發現，80%以上的細胞處于G0/G1期，S期占43%，G2期占102%，這說明大部分細胞處于靜止狀態，但仍保留自我更新和增殖能力，這符合干細胞的特性。流式細胞儀檢測發現，MSCs均表達CD73、CD105和HLA-ABC，不表達CD34、CD45和免疫相關表型HLA-DR，HLA-DR是引起免疫排斥反應的主要因素，說明臍帶MSCs可能是免疫原性相對較弱的一類細胞，這和骨髓源的MSCs具有相似的形態和免疫表型[29]，與國際定義的MSCs標準相一致[30]。有報道稱，骨髓MSCs高表達CD106[31]，推測低表達CD106有可能是外周來源MSCs與骨髓來源MSCs的鑒別點之一。

總之，本實驗從人臍帶中消化分離得到大量的MSCs，且最佳消化時間為5h，體外易于培養擴增，增殖能力強，臍帶MSCs病毒感染機會小，對供者和患者無不良影響，因此有望成為組織工程研究的種子細胞和臨床應用良好的間充質干細胞來源。

參考文獻

[1]Salamon A，Toldy E.The role of adult bone marrow derived mesenchymal stem cell，growth factors and carriers in the treatment of cartilage and bone defects[J].J Stem Cell，2009，4（1）：71-80.

[2]李炳堯，武曉云，吳巖. 間充質干細胞的分離與培養：從實驗室到臨床[J].中國組織工程研究，2013，17（14）：2649-2655.

[3]Fu S，Cheng YC，Lin MY，et a1.Conversion of human umbilical mesenchymal stem cells in Wharton，s jelly to dopa minergic neurons in vitro-potential therapeutic application for Parkinsonism.[J].Stem Cells，2006，24：l15-124.

[4]Laughlin MJ，Barker JN，Bambach B，et al.Hematopoietic engraftment and survival in adult recipients of umbilical-cord blood from unrelated donors.N Engl [J]. Med，2001，344（24）：1815-1822.

[5]Rocha V，Cornish J，Sieners EL，et al.Comparison of outcomes of unrelated bone marrow and umbilical cord blood transplants in children with acute leukemia[J].Blood，2001，97，（10）：2962-2971.

[6]Dominici M， Le Blanc K， Mueller I， et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement[J]. Cytotherapy，2006，8（4）：315-317.

[7]Da Silva Meirelles L， Caplan AI， Nardi NB. In search of the invivo identity of mesenchymal stem cells[J]. Stem Cells，2008，26（9）：2287-2299.

[8]Liu L， Zhao X， Li P，et al. A novel way to isolate MSCs from umbilical cords[J]. Eur J Immunol，2012，42（8）：2190-2193.

[9]王娟. 人臍帶間充質干細胞體外分離、純化及鑒定[J]. 暨南大學學報（醫學版），2009，30（4）：367-372.

[10]Covas DT， Siufi JL， Silva AR， et al. Isolation and culture of Umbilical vein mesenchymal stem cells[J] Braz J Med Biol Res，2003，36： 1179-1183.

[11]Saugaser R， Lickorish D， Baksh D， et al. Human umbilical cord perivascular cells： a sourse of mesenchymal progenitors[J]. Stem Cells，2005， 23（2）： 220-229.

[12]Karahuseyinoglu S， Cinar O， Kilic E， et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma： in situ and in vitro surveys[J]. Stem Cells，2007，25（2）：319-331.

[13]陳宇，張寧坤，楊明，等.臍帶華通膠間充質干細胞的分離培養及鑒定[J].中國現代醫學雜志， 2010，20（16）： 2412-2415.

[14]侯克東，盧世璧，張莉，等.人臍帶Wharton膠中間充質干細胞的分離、培養與鑒定[J].解放軍醫學雜志，2008，33（4）：375-378.

[15]王恒湘，郭子寬.間充質干細胞在組織再生應用中的諸多問題[J].組織工程與重建外科雜志，2008，4（5）：241-245.

[16]Rahul S，David L，Dolores B，et a1.Human umbilical cord perivascular（HUCPV）cells：a source of mesenchymal progenitors[J].Stem Cells，2005，23（2）：220-229.

[17]Lavik E，Langer R.Tissue engineering：current state and perspectives[J].Appl Microbiol Biotechnol，2004，65（1）：1-8.

[18]蔣潔，譚燦，肖玲，等.臍帶沃頓膠間充質干細胞的分離培養及其誘導分化[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（10），1734-1738.

[19]FU Y S，CHENG Y C，LIN M Y，et a1.Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton，s jelly to dopaminergic neurons in vitro：potential therapeutic application for Parkinsonism[J].Stem Cells，2006，24（1）：115-124.

[20]Mark L. Weiss，Deryl L. Troyer.Stem cells in the umbilical cord[J].Stem Cell Rev，2006，2（2）：155-162.

[21]盧兆桐，李福泉.臍帶間充質干細胞分離培養及其定向分化研究[J].中華實驗外科雜志，2012，29（8）：1630.

[22]哈承志，王大偉. 臍帶間充質干細胞在骨組織工程中的應用進展[J]. 中國組織工程研究，2012，16（1）：158-162.

[23]扈江偉，張顥，徐曼，等. 臍帶全層源間充質干細胞分離培養及向成軟骨細胞分化的實驗研究[J].創傷外科雜志，2012，14（6）：531-534.

[24]Wang HS，Hung SC，Peng ST，et al.Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord[J].Stem Cells，2004，22（7）：1330-1337.

[25]SASAKI E，HANAZAWA K，KURITA R，et al.Establishment of novel embryonic stem cell lines derived from the common marmoset （Callithrixjacehus） [J].Stem Cells，2005，23（9）：1304.

[26]Erices A，Conget P，Minguell J J.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood[J].Br J Haematol，2000，109（1）：235-242.

[27]Mohyeddin Bonab MA，Alimoghaddam K A，Goliaei Z A，et al.Which factors can affect cord blood variables[J].Transfusion，2004，44（5）：690-693.

[28]XU Qian，ZHAO Lian-san，WANG Li-chun，et al.Exploration of Isolation and Culture of Human Umibilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells[J].West China Hospital，2005，20（2）：285-287.

[29]In，t Ankera P S，Noortb W A，Kruisselbrinkb A B，et al.Nonexpanded Primary Lung and Bone Marrow-derived Mesenchymal Cells Promote the Engraftment of Umbilical Cord Bloodderived CD34+ Cells in NOD/SCID Mice[J].Experimental Hematology，2003，31：881-889.

[30]Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et，al.Minimal criteriafor defining multipotent mesenchymal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy，2006，8（4）：315-317.

[31]呂璐璐，宋永平，魏旭東，等.人臍帶和骨髓源間充質干細胞生物學特征的對比研究[J].中國實驗血液學雜志，2008，16（1）：140-146.

[18]蔣潔，譚燦，肖玲，等.臍帶沃頓膠間充質干細胞的分離培養及其誘導分化[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（10），1734-1738.

[19]FU Y S，CHENG Y C，LIN M Y，et a1.Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton，s jelly to dopaminergic neurons in vitro：potential therapeutic application for Parkinsonism[J].Stem Cells，2006，24（1）：115-124.

[20]Mark L. Weiss，Deryl L. Troyer.Stem cells in the umbilical cord[J].Stem Cell Rev，2006，2（2）：155-162.

[21]盧兆桐，李福泉.臍帶間充質干細胞分離培養及其定向分化研究[J].中華實驗外科雜志，2012，29（8）：1630.

[22]哈承志，王大偉. 臍帶間充質干細胞在骨組織工程中的應用進展[J]. 中國組織工程研究，2012，16（1）：158-162.

[23]扈江偉，張顥，徐曼，等. 臍帶全層源間充質干細胞分離培養及向成軟骨細胞分化的實驗研究[J].創傷外科雜志，2012，14（6）：531-534.

[24]Wang HS，Hung SC，Peng ST，et al.Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord[J].Stem Cells，2004，22（7）：1330-1337.

[25]SASAKI E，HANAZAWA K，KURITA R，et al.Establishment of novel embryonic stem cell lines derived from the common marmoset （Callithrixjacehus） [J].Stem Cells，2005，23（9）：1304.

[26]Erices A，Conget P，Minguell J J.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood[J].Br J Haematol，2000，109（1）：235-242.

[27]Mohyeddin Bonab MA，Alimoghaddam K A，Goliaei Z A，et al.Which factors can affect cord blood variables[J].Transfusion，2004，44（5）：690-693.

[28]XU Qian，ZHAO Lian-san，WANG Li-chun，et al.Exploration of Isolation and Culture of Human Umibilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells[J].West China Hospital，2005，20（2）：285-287.

[29]In，t Ankera P S，Noortb W A，Kruisselbrinkb A B，et al.Nonexpanded Primary Lung and Bone Marrow-derived Mesenchymal Cells Promote the Engraftment of Umbilical Cord Bloodderived CD34+ Cells in NOD/SCID Mice[J].Experimental Hematology，2003，31：881-889.

[30]Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et，al.Minimal criteriafor defining multipotent mesenchymal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy，2006，8（4）：315-317.

[31]呂璐璐，宋永平，魏旭東，等.人臍帶和骨髓源間充質干細胞生物學特征的對比研究[J].中國實驗血液學雜志，2008，16（1）：140-146.

[18]蔣潔，譚燦，肖玲，等.臍帶沃頓膠間充質干細胞的分離培養及其誘導分化[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（10），1734-1738.

[19]FU Y S，CHENG Y C，LIN M Y，et a1.Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton，s jelly to dopaminergic neurons in vitro：potential therapeutic application for Parkinsonism[J].Stem Cells，2006，24（1）：115-124.

[20]Mark L. Weiss，Deryl L. Troyer.Stem cells in the umbilical cord[J].Stem Cell Rev，2006，2（2）：155-162.

[21]盧兆桐，李福泉.臍帶間充質干細胞分離培養及其定向分化研究[J].中華實驗外科雜志，2012，29（8）：1630.

[22]哈承志，王大偉. 臍帶間充質干細胞在骨組織工程中的應用進展[J]. 中國組織工程研究，2012，16（1）：158-162.

[23]扈江偉，張顥，徐曼，等. 臍帶全層源間充質干細胞分離培養及向成軟骨細胞分化的實驗研究[J].創傷外科雜志，2012，14（6）：531-534.

[24]Wang HS，Hung SC，Peng ST，et al.Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord[J].Stem Cells，2004，22（7）：1330-1337.

[25]SASAKI E，HANAZAWA K，KURITA R，et al.Establishment of novel embryonic stem cell lines derived from the common marmoset （Callithrixjacehus） [J].Stem Cells，2005，23（9）：1304.

[26]Erices A，Conget P，Minguell J J.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood[J].Br J Haematol，2000，109（1）：235-242.

[27]Mohyeddin Bonab MA，Alimoghaddam K A，Goliaei Z A，et al.Which factors can affect cord blood variables[J].Transfusion，2004，44（5）：690-693.

[28]XU Qian，ZHAO Lian-san，WANG Li-chun，et al.Exploration of Isolation and Culture of Human Umibilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells[J].West China Hospital，2005，20（2）：285-287.

[29]In，t Ankera P S，Noortb W A，Kruisselbrinkb A B，et al.Nonexpanded Primary Lung and Bone Marrow-derived Mesenchymal Cells Promote the Engraftment of Umbilical Cord Bloodderived CD34+ Cells in NOD/SCID Mice[J].Experimental Hematology，2003，31：881-889.

[30]Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et，al.Minimal criteriafor defining multipotent mesenchymal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy，2006，8（4）：315-317.

[31]呂璐璐，宋永平，魏旭東，等.人臍帶和骨髓源間充質干細胞生物學特征的對比研究[J].中國實驗血液學雜志，2008，16（1）：140-146.