非甾體類消炎藥雙氯芬酸抑制間充質干細胞向肌腱細胞增殖分化的研究

呂天旻　俞富祥　張甦　張建國

[摘要] 目的 探討NSAIDs對間充質干細胞向肌腱細胞增殖分化過程的影響。 方法 體外建立鼠間充質干細胞系 C3H10T1/2 的肌腱細胞分化模型；CCK-8比色法分別檢測雙氯芬酸（diclofenac，DF）對間充質干細胞增殖的影響；用生長分化因子-7（growth differentiation factor，GDF-7）誘導鼠間充質干細胞系C3H10T1/2分化為肌腱細胞；PCR 檢測間充質干細胞分化過程中肌腱細胞相關基因（腱調(diào)蛋白、膠原蛋白）的表達。PCR 分別檢測 DF 對間充質干細胞分化過程中相關基因[腱調(diào)蛋白、脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（aP2）]表達的影響。 結果 成功建立鼠間充質干細胞系C3H10T1/2 的肌腱細胞分化模型；DF高濃度時明顯抑制間充質干細胞增殖（24 h：t=2.357，3.524，P<0.05。72 h：t=3.217，3.592，P<0.05）；GDF-7成功誘導鼠間充質干細胞系 C3H10T1/2 分化為肌腱細胞，肌腱細胞相關基因表達明顯增加（腱調(diào)蛋白：t=124.107，P<0.05；Ⅰ型膠原蛋白α1：t=38.107，P<0.05）；DF對間充質干細胞分化過程中抑制了肌腱基因的表達（DF：腱調(diào)蛋白：t=31.758，P<0.05），增強了脂肪相關基因的表達[（DF：脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（aP2）：t=97.735，P<0.05）]。 結論 高濃度時 DF 抑制間充質干細胞增殖，改變間充質干細胞分化方向，不利于肌腱細胞再生修復。

[關鍵詞] 間充質干細胞；肌腱細胞；增殖分化；生長分化因子

[中圖分類號] R915 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）04-0005-05

Study of inhibition of proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells into tendon cells by non-steroidal anti-inflammatory drugs of diclofenac

LV Tianmin YU Fuxiang ZHANG Su ZHANG Jian'guo

School of Medicine， Huzhou University， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of NSAIDs on the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells to tendon cells. Methods The differentiation model of tendon cells of rat mesenchymal stem cell line C3H10T1/2 was established in vitro. The effect of diclofenac（DF） on the proliferation of mesenchymal stem cells was detected by CCK-8 colorimetric assay. The differentiation of rat mesenchymal cell line C3H10T1/2 was induced by growth differentiation factor-7（GDF-7） into tendon cells. PCR was used to detect the expression of tendon-associated genes（tendon protein and collagen）during mesenchymal differentiation. PCR was used to detect the effect of DF on the expression of related genes[tonicgulin； adipocyte type fatty acid binding protein（aP2）] during differentiation of mesenchymal stem cells. Results The model of differentiation of tendon cells in rat mesenchymal cell line C3H10T1/2 was established successfully. When DF was at high concentration， mesenchymal cell proliferation was significantly inhibited（24 h：t=2.357，3.524，P<0.05. 72 h：t=3.217，3.592，P<0.05）；GDF-7 successfully induced the differentiation of rat mesenchymal cell line C3H10T1/2 into tendon cells. The expression of related genes of tendon cells was significantly increased（TNMD：t=124.107， P<0.05；type Ⅰcollagen protein α1：t=38.107，P<0.05）；DF inhibited the expression of tendon genes during the process of the differentiation of mesenchymal stem cells（DF：TNMD：t=31.758，P<0.05）， and the expression of fat-related genes was increased（DF：aP2：t=97.735，P<0.05）. Conclusion DF can inhibit the proliferation of mesenchymal stem cells and change the direction of mesenchymal differentiation in high concentration. It is not conducive to regeneration and repair of tendon cells.

[Key words] mesenchymal stem cells； Tendon cells； Proliferation and differentiation； Growth differentiation factors

肌腱是膠原結締組織，連接骨骼和肌肉，是關節(jié)運動的基礎。然而，在體育運動、體力勞動過程中，這種反復性的負荷運動易導致肌腱的損傷，從而引起慢性炎癥，典型的表現(xiàn)是局部疼痛及運動障礙，這些情況下常經(jīng)驗性地給予NSAIDs抗炎治療。目的在于緩解癥狀和改善運動障礙。然而在生物藥理學上，基于這些藥物的治療對于肌腱再生的影響作用尚未明確。利用已報道的實驗方法[1，2]，用生長分化因子-7（GDF-7）誘導鼠間充質干細胞系C3H10T1/2分化為肌腱細胞。評估雙氯芬酸（DF）對間充質干細胞向肌腱細胞增殖分化過程的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

鼠間充質干細胞系C3H10T1/2，由溫州醫(yī)科大學外科實驗中心提供；L-DMEM培養(yǎng)基，購自Hyclone公司；小牛血清購自Gibco公司；雙氯芬酸（DF）購自Sigma公司；生長分化因子-7（GDF-7）購自R&D公司；CCK-8試劑盒購自溫州長風生物科技公司；PCR試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 方法

（1）細胞培養(yǎng) 大鼠間充質干細胞（C3H10TY1/2）用含10%小牛血清的L-DMEM常規(guī)培養(yǎng)，孵育箱（型號：MCO-20AIC，SANYO）95%O2和5%CO2，每2～3天換液1次。

（2）CCK-8比色法檢測DF對間充質干細胞增殖的影響 將處于對數(shù)生長期的間充質干細胞消化傳代，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞數(shù)為 1×104接種于 96孔板中，換無血清的 DMEM 培養(yǎng)液，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后按不同濃度分別向各孔中加入DF（終濃度分別為 0、1、10、100、1000 μL），每個濃度設 5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 或 72 h 后每孔加入CCK-8 溶液80 uL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用自動酶標儀（型號：WD-2102A，杭州匯爾儀器設備有限公司）于450 nm 處檢測每孔的吸光度（A）值，以藥物濃度為0的實驗組為對照組，間接計算細胞增殖程度。

（3）GDF-7誘導間充質干細胞向肌腱細胞分化 將間充質干細胞鋪于6孔板中，每孔細胞5×105，加入終濃度為50 ng/mL 的 GDF-7 及終濃度 50 μg/mL的抗壞血酸，培養(yǎng) 6 d，誘導間充質干細胞向肌腱細胞分化。

（4）PCR檢測間充質干細胞向肌腱細胞分化過程中Ⅰ型膠原蛋白α1、腱調(diào)蛋白的mRNA表達以未加藥物的實驗組為對照組，在間充質干細胞向肌腱細胞誘導分化過程中，請長風生物科技公司設計大鼠膠Ⅰ型原蛋白α1、腱調(diào)蛋白及內(nèi)參GAPDH的引物，利用PCR技術，分別測定各組細胞中上述基因的mRNA表達情況。具體如下：Ⅰ型膠原蛋白α1上游引物：5-GAGCGGAGAGTACTGGATCG -3，下游引物：5-GCTTCTTTTCCTTGGGGTTC -3，擴展片斷長195 bp；腱調(diào)蛋白上游引物：5-TGTACTGGATCAATCCCACTCT -3，下游引物：5-GCTCATTCTGGTCAACTCCCCT-3，擴增片斷長213 bp；GAPDH上游引物：5-AGGACCAGGTTGTCTCCTG-3，下游引物：5-GGATGGAATTGTGAGGGAGA-3，擴增片斷長215 bp；用GAPDH為引物鑒定cDNA，分別擴增目標基因。反應條件：95℃ 20 s 預變性，擴增40個循環(huán)，每個循環(huán)包括：90℃ 變性3 s，52.1℃ 退火30 s，60℃ 延伸30 s。

（5）DF對充質細胞形態(tài)的影響 PCR檢測DF對間充質干細胞向肌腱細胞分化過程中腱調(diào)蛋白、脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（aP2）的mRNA表達影響。在間充質干細胞向肌腱細胞誘導分化過程中，從開始分化到第6天各組細胞加入 DF 1000 μL，然后顯微鏡（型號：XDS-100，上海蔡康光學儀器有限公司）下觀察細胞形態(tài)的變化，并分析肌腱細胞、脂肪細胞的標志物表達。腱調(diào)蛋白、脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（aP2）及內(nèi)參 GAPDH 的引物，具體如下：腱調(diào)蛋白上游引物：5- TGTACTGGATCAATCCCACTCT-3，下游引物：5- GCTCATTCTGGTCAACTCCCCT-3，擴增片斷長213 bp；脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（aP2）上游引物：5- CATGGCCAAGCCCAACAT -3，下游引物：5-CGCCCAGTTTGAAGGAAATC -3，擴增片斷長339 bp；GAPDH上游引物：5-GAGGACCAGGTTGTCTCCTG-3，下游引物：5-GGATGGAATTGTGAGGGAGA-3，擴增片斷長 215 bp；用 GAPDH 為引物鑒定cDNA，分別擴增目標基因。反應條件：95℃ 20 s 預變性，擴增40個循環(huán)，每個循環(huán)包括：90℃ 變性3 s，52.1℃ 退火30 s，60℃ 延伸30 s。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)資料利用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DF抑制間充質干細胞的增殖

用 CCK-8 試劑盒做細胞增殖測定，DF 作用于間充質干細胞 24 h，濃度100 μL、1000 μL的實驗組與對照組比較表現(xiàn)出抑制作用（t=2.357，3.524，P<0.05），而其他濃度的實驗組均未顯示出抑制作用。DF作用于間充質干細胞72 h，濃度100 μL、1000 μL的實驗組與對照組比較表現(xiàn)出抑制作用（t=3.217，3.592，P<0.05），而其他濃度的實驗組均未顯示出抑制作用。見表1、圖1。

表1 各培養(yǎng)體系中的吸光度比較（x±s）

2.2 GDF-7促進間充質干細胞的分化

GDF-7誘導間充質干細胞向肌腱細胞分化，可見 GDF-7增強肌腱細胞標志物腱調(diào)蛋白和膠原蛋白1α1的表達（腱調(diào)蛋白：t=124.107，P<0.05；Ⅰ型膠原蛋白α1：t=38.107，P<0.05）。見表2、圖2。

圖2 GDF-7促進間充質干細胞的分化

2.3 DF對間充質干細胞向肌腱細胞分化的影響

GDF-7促進了間充質干細胞向肌腱細胞分化，但加入DF后，發(fā)現(xiàn)將間充質干細胞中脂肪細胞出現(xiàn)增加，見封三圖3A-B。進一步通過 PCR 檢測發(fā)現(xiàn) DF明顯抑制了GDF-7誘導的間充質干細胞的腱調(diào)蛋白表達（DF：腱調(diào)蛋白：t=31.758，P<0.05）。同時增強了脂肪細胞標記物脂肪酸結合蛋白表達（DF：脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（aP2）：t=97.735，P<0.05），見表3、圖3。

3 討論

肌腱前體細胞具有干細胞的性質。可分化為多種間葉組織細胞，如骨骼，脂肪，軟骨另外還有肌腱[3-5]。肌腱病變在組織學上表現(xiàn)出肌腱細胞總數(shù)顯著下降，“非肌腱細胞”堆積，包括肌成纖維細胞，脂肪細胞，軟骨細胞還有成骨細胞[6]。因此，從生物學角度來說，肌腱病變可能歸咎于肌腱干細胞再生活動“失去控制”，肌腱細胞分化受損而向其它間葉組織分化，肌腱損傷是最常見的運動損傷之一，包括因關節(jié)長期的運動、摩擦或勞損引起炎癥后肌腱末端局部組織變性，及急性運動創(chuàng)傷造成的肌腱斷裂缺損，是運動醫(yī)學中公認的治療難題。隨著人們體育活動增多，學習、工作和生活方式的改變（電腦、手機的普及等），肌腱損傷日益增多。每億人口中一年至少有上千萬的肌腱損傷病例。同時，肌腱損傷也對許多優(yōu)秀運動員的職業(yè)生涯產(chǎn)生巨大威脅，如我國著名跨欄運動員劉翔，英國足球運動員皆因肌腱受損而暫別賽場。目前，臨床上對肌腱損傷的治療的主要方法是理療、手術縫合等，雖有一定效果，但是療效有限，修復后肌腱的質量遠不如正常肌腱，易出現(xiàn)肌腱粘連，肌腱結構和力學性能低下，常重復斷裂[3，4]。即使是自體肌腱移植修復也只能達到正常肌腱力學性能的左右，且伴隨有大量疤痕組織增生。相對于其他組織和器官的疾病治療而言，對肌腱損傷的臨床治療進展緩慢，主要原因是肌腱基本發(fā)育生物學知識的相對缺乏。因此，更好的認識肌腱發(fā)育和分化的生理學和分子信號網(wǎng)絡，可為肌腱損傷的治療提供新的方法和思路。成熟的肌腱是由致密的膠原纖維和參與調(diào)節(jié)膠原纖維結構的大量細胞外基質分子，如膠原，纖維間基質復合物，蛋白多糖等組成的[5]。這些細胞外基質對肌腱功能的維持有重要作用。從組成結構上講，肌腱這種特殊的細胞外基質結構，加之內(nèi)部血管和神經(jīng)的缺乏，也在一定程度上造成了肌腱修復的困難。用 GDF-7 誘導成纖維樣細胞 C3H10T1/2 分化為肌腱細胞。GDF-7屬于轉化生長因子 beta 超家族，它能誘導細胞肌腱樣結構形成[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，當間充質干細胞暴露于GDF-7時，兩種肌腱相關蛋白腱調(diào)蛋白和Ⅰ型膠原蛋白a1表達顯著增加，與當前的報道一致。

NSAIDs 也廣泛的應用于減輕軟組織損傷疾病引起的疼痛和炎癥。它們通過增強COX活性，從而減少促炎癥反應因子前列腺素合成來抑制組織炎癥。常被運動員用于外傷性損傷和負荷行損傷的止痛[7]。DF屬于NSAIDs，可快速而持久的止痛，且有良好的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)在DF高濃度情況下，出現(xiàn)顯著的抑制細胞生長和誘導脂肪形成，但是在較低濃度（1、10 μL情況下沒有觀察到這種現(xiàn)象，這個發(fā)現(xiàn)與當前體外研究一致[8，9]，有研究認為 DF 在濃度 6、7 μL時對肌腱細胞增殖和糖胺聚糖合成沒有負面影響。由于他們是在口服或局部使用 DF 后，血清和軟組織中DF 濃度很少超過10 μL，因此，有理由認為口服和局部使用DF，肌腱有害作用不太可能發(fā)生。然而，肌肉注射DF在術后止痛中很常見[10]，且局部DF注射治療手部腱鞘炎已有報道，在這些情況下腱內(nèi)的DF濃度可以超過100 μL。因此，評估其安全性的過程中應該將這些對肌腱副作用計入其中[11，12]。在美國雙氯芬酸被作為成人治療輕度至中度疼痛使用，并作為單藥或與阿片類鎮(zhèn)痛藥合用中度至重度疼痛的管理[13]。在兩個多中心，成人急性中度至重度的Ⅲ期研究嚴重的術后疼痛，HPBCD雙氯芬酸顯著減輕疼痛強度和對急救藥物的需求與安慰劑比較[14，15]。在這些研究中，耐受性雙氯芬酸的輪廓大體相似，安慰劑組和不良事件大多為輕度至中度較嚴重[16]。便秘、輸液部位疼痛、頭暈是最常見的不良反應數(shù)值更頻繁發(fā)生氯滅痛比安慰劑[17，18]。與安慰劑相比雙氯芬酸治療似乎并未增加心血管、腎或出血相關的不良事件[19]。因此，目前雙氯芬酸可延伸用于管理的治療方案成人中度至重度術后疼痛的研究[20，21]。

綜上所述，本研究建立了一個相對簡單可靠的體外實驗模型，可用來研究肌腱多功能前體細胞成肌腱細胞分化[22]。研究結果顯示，一些常規(guī)用于肌肉損傷對癥治療的藥物如DF，在祖細胞水平對肌腱再生有比較大的抑制作用，因此慎重使用[23]。

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（收稿日期：2016-10-12）