Ang-1和Tie2在高血壓患者內皮祖細胞中表達水平及臨床意義研究

馮 曉 潘 峰 張臘紅 樓洪萍 張邢煒 陳兆軍

杭州師范大學附屬醫院，浙江杭州 310015

高血壓的嚴重程度與血管內皮細胞的損害程度呈正相關，作為前體細胞，內皮祖細胞具有較強的增殖、分化潛能，參與損傷內皮細胞的修復、維持血管穩定，因此對于防止動脈粥樣硬化及再狹窄具有重要意義[1-2]。血管生成素-1（Ang-1）及其酪氨酸激酶受體Tie2是血管生成的重要調節因子，廣泛表達于內皮祖細胞上，對于調控內皮祖細胞的功能具有重要意義[3-4]。本研究通過不同分級的原發性高血壓患者內皮祖細胞Ang-1/Tie2的表達變化，探討Ang-1/Tie2信號通路在修復與逆轉疾病發展中的重要價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇杭州師范大學附屬醫院2012年1月～2013年6月住院的原發性高血壓患者45例為觀察組，其中男 23例，女 22例；年齡 38～71歲，平均（54.35±6.58）歲；依據WHO/ISH對高血壓的診斷和分級標準，分為Ⅰ級[血壓（145～159）/（90～99）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）]、Ⅱ級[血壓（160～179）/（100～109）mm Hg]和Ⅲ級[血壓≥180/110 mm Hg]高血壓患者，各15例。選擇同時期正常體檢人群30名為對照組，男女各15名；年齡 39～70 歲，平均（53.64±6.17）歲。 各組性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。剔除糖尿病、潰瘍、外傷、近期外科手術、腫瘤、炎癥等影響內皮祖細胞疾病的患者以及近3個月無急性心肌梗死、心絞痛發生患者。

1.2 方法和試劑

1.2.1 主要試劑和儀器

QIAGEN RNA提取試劑盒（基因公司），RT-PCR試劑盒與引物合成（武漢博士得生物工程有限公司），PCR儀 （德國 Biometra公司）；DNA Marker DL2000（大連 TaKaRa公司）。Control Primer：β-actin（532 bp）；Ang-1 基因 （312 bp） 引物：5′-TCCGGTGAATATTG GCTGGG-3′，5′-AAATCGCTGTCTGATCTTCTTCCAT-3′；Tie2 （512 bp）引物：5′-ATGGACTCTTTAGCCGGCTTA-3′，5′-CCTTATAGCCTGTCCTCGAA-3′。 總蛋白提取試劑盒SBS（Genetech公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，MERCK公司）；抗人Tie2酪氨酸磷酸化抗體、抗人β-actin抗體以及HPR標記的二抗均來自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2.2 治療方法

針對Ⅱ級和Ⅲ級高血壓患者采取常規降壓方案，主要包括β受體阻斷劑、鈣離子拮抗劑、阿司匹林以及他汀類藥物，連續使用4周，所有患者治療后血壓均達到130/80 mm Hg以下。

1.2.3 Ang-1和Ti e2水平測定

所有研究對象入選前1周內未服用任何降壓藥和抗氧化劑，清晨分別抽取空腹外周血20 mL置入無菌肝素抗凝管內，加入Ficoll液4℃離心分離單個核細胞層并采用差速貼壁法純化內皮祖細胞。

1.2.3.1 采用RT-PCR法測定Ang-1和Tie2 mRNA水平 分別提取各組內皮祖細胞總RNA，合成cDNA：加入總 RNA 2μg，oligo dT 1μL，RNA 逆轉錄酶 1μL，無RNA去離子水共20μL，輕輕混勻后，70℃變性5 min，42℃ 2 h，冰浴。分管進行Ang-1、Tie2和 β-actin基因PCR，95℃ 5 min，94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 45 s，30 個循環，72℃5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，通過圖像分析儀進行灰度分析，分別測定Ang-1/β-actin以及Tie2/β-actin灰度比值。

1.2.3.2 采用Western-blot法測定Tie2酪氨酸磷酸化水平 分別提取各組內皮祖細胞總蛋白后取20μg，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃轉膜12 h，蛋白封閉，加入抗Tie2酪氨酸磷酸化一抗、二抗，顯影、壓片。膠片經圖像分析系統測得Tie2磷酸化/β-actin光密度比值反映體內活化Tie2受體表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組內皮祖細胞 Ang-1、Tie2 mRNA表達和Tie2酪氨酸磷酸化水平比較

本次實驗結果顯示，Ⅲ級高血壓患者內皮祖細胞Ang-1和Tie2 mRNA表達分別顯著低于Ⅱ、Ⅰ級高血壓患者和對照組（P＜0.05）；Ⅱ級高血壓患者內皮祖細胞Ang-1和Tie2 mRNA表達低于Ⅰ級高血壓患者和對照組（P＜0.05）。內皮祖細胞內受體蛋白水平：Ⅲ級高血壓患者活化Tie2水平明顯低于Ⅱ、Ⅰ級高血壓患者和對照組（P＜0.05）；Ⅱ級高血壓患者Tie2磷酸化水平低于Ⅰ級高血壓患者和對照組（P＜0.05）。對照組和Ⅰ級高血壓患者內皮祖細胞內Ang-1、Tie2 mRNA表達以及Tie2磷酸化水平差異無統計學意義 （P＞0.05）。見表 1。

表1 各組內皮祖細胞Ang-1、Tie2 mRNA表達和Tie2酪氨酸磷酸化水平比較（x±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與高血壓Ⅰ級比較，△P＜0.05；與高血壓Ⅱ級比較，▲P＜0.05

2.2 治療前后內皮祖細胞Ang-1和Tie2水平表達變化

Ⅱ級、Ⅲ級高血壓患者經治療后內皮祖細胞Ang-1和Tie2 mRNA表達均高于治療前水平（P＜0.05）。治療后內皮祖細胞Tie2酪氨酸磷酸化水平上調（P＜0.05）。見表2。

表2 治療前后內皮祖細胞Ang-1、Tie2表達和Tie2酪氨酸磷酸化水平比較（x±s）

3 討論

原發性高血壓形成的高血流應切力可直接損傷血管內皮細胞。血壓越高，損傷越大，越難以修復，進而發展為動脈粥樣硬化、冠心病等嚴重合并癥[5-7]。內皮祖細胞是具有增殖分化為血管內皮細胞的一類前體細胞，與新生血管生成、內皮細胞修復有關[8]。然而越來越多的研究發現[9-11]，高血壓患者循環內皮祖細胞數量減低、功能障礙，內皮細胞得不到修復與更新，病情無法逆轉。如何解釋這一現象對于疾病的控制至關重要。

Tie2是一類酶聯受體，廣泛表達于內皮細胞及內皮祖細胞上，Ang-1、Ang-2是其主要配體，Ang-1能保持血管內皮的穩定性，促使血管成熟；Ang-2是Ang-1內源性拮抗劑，破壞血管的穩態。Ang-1與Tie2受體結合后酪氨酸殘基被磷酸化進而發揮細胞的生物學功能[12-14]。內皮祖細胞修復內皮細胞的過程，很可能依賴Ang-1/Tie2信號通路精密調控，通路表達失衡可直接影響內皮祖細胞的動員和遷移，加速血管內皮的損傷及炎癥過程[15-16]。內皮祖細胞上Ang-1/Tie2通路表達與高血壓之間的關系目前國內鮮有研究。

本次實驗結果顯示，隨著患者高血壓分級的增高，內皮祖細胞Ang-1和Tie2 mRNA水平逐級降低，且具有生物活性的磷酸化Tie2水平也平行下調，表明信號通路的活性降低，血管內皮細胞的修復能力減弱，從而解釋了內皮祖細胞數量下降及功能喪失的原因。同時也觀察到，經過降壓治療后，Ang-1和Tie2的表達明顯改善，說明高血壓的因素去除之后，內皮細胞的修復活動增強，再次證實了內皮祖細胞依賴Ang-1/Tie2系統調控的推斷。

此外，本研究也發現，高血壓Ⅰ級患者的Ang-1和Tie2水平較之對照組并無明顯差異，推測此階段的內皮祖細胞仍具有較強的代償能力，機體處于平衡狀態，血壓控制之后，發生心血管意外的概率明顯低于其他兩組。因此，內皮祖細胞Ang-1和Tie2表達也可作為預測血管功能和心血管危險度的指標之一[17-20]。

綜上所述，內皮祖細胞Ang-1/Tie2的表達可能與高血壓病血管損傷有密切關系，可通過Ang-1/Tie2表達的水平對患者的血管損傷程度和治療效果進行判斷，進而在臨床上發揮重要作用。

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