聚乙二醇/β谷甾醇雙接枝殼聚糖共聚物納米粒的體外釋放與體內分布考察

凌 柏

(江蘇省鹽城市第一人民醫院藥劑科，江蘇 鹽城 224001)

近年來，納米技術在醫藥領域得到了廣泛的應用，以高分子材料包裹化學治療藥物制成載藥納米粒可以達到緩釋、靶向給藥的目的，減少藥物的毒副作用[1]。如用脂質體包裹阿霉素，已在臨床上得到了應用，但脂質體本身靶向分布不理想，且包封率低、穩定性差。因此，尋找更佳的載體材料是目前的一個研究熱點。兩親性聚合物能在水性介質中通過自組裝方式形成納米粒子。該納米粒具有獨特的核殼結構，適合作為疏水性藥物的載體;并且由于增強了滲透性和阻留效應，能在腫瘤病變部位富集，實現對腫瘤組織的“被動靶向性”，用作抗腫瘤藥物的載體時能增加藥物療效，降低藥物毒副作用。殼聚糖[2]是目前已知的天然多糖中唯一的堿性多糖，具有無毒性、無刺激性、無免疫原性、可降解性及優良的生物相容性，同時由于它含有某些有助于細胞黏附和保持細胞分化功能的信息，因此，殼聚糖及其衍生物已廣泛應用于納米給藥載體[3－11]。本研究中以β谷甾醇為疏水組分、聚乙二醇(PEG)為親水組分接枝至殼聚糖，制備了一種新型殼聚糖衍生物——PEG/β谷甾醇雙接枝殼聚糖(PSC)，在水中PSC可自組裝形成以β谷甾醇為疏水核心、PEG為親水外殼的核－殼結構的納米粒。PEG是親水柔性大分子，在納米粒外層形成的親水層可減弱血漿蛋白的吸附，減少肝、脾中巨噬細胞的吞噬，使納米粒在血液中具有“長循環”能力，而“長循環”能力是實現主動靶向的前提。β谷甾醇是人體需要的物質，具有很好的安全性和生物相容性，同時還可抑制膽固醇的吸收，維持膽固醇水平，降低動脈粥樣硬化的可能性。本研究中主要對PSC納米粒的自組裝性能及體內組織分布進行了初步的探索與評價。

1 儀器與試藥

F－4600型熒光分光光度計(日本Olympus公司);DF－Z型集熱力磁力加熱攪拌器，KQ－ZOOKD型高頻率數控超聲清洗器(昆山超聲儀有限公司);SHZ－82型旋轉氣浴恒溫振蕩器(上海比朗儀器有限公司);SCMO旋轉蒸發儀(上海中生科技有限公司);冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司);85－1型恒溫磁力攪拌器(常州國華儀器有限公司);MIKRO－200R型高速冷凍離心機(德國Hettich);XW－80A型微型旋渦混合儀(上海瀘西分析儀器廠有限公司)。

PSC(實驗室自制);聚乙二醇1000(PEG1K，西隴化工股份有限公司，CP，批號為120315);聚乙二醇2000(PEG2K，西隴化工股份有限公司，CP，批號為120730);香豆素－6，羅丹明B(上海紫一試劑廠，AR，批號為 20130225);丁二酸酐(CP，≥99.0%，批號為 T20100412);β 谷甾醇(＞75.0% ，批號為 A1203123);葉酸，四氫呋喃(THF，≥99.0%，批號為 T20111028);N，N－二甲基甲酰胺(DMF，批號為 T201110511);草酰氯(阿拉丁，CP，≥98.0%，批號為T200880325);氫化鈣(阿拉丁，AR，批號為C1201027);甲烷磺酸(阿拉丁，99.0%，批號為39004);乙酸乙酯，甲醇，無水乙醇等其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 PSC及其納米粒制備

PSC:將PEG1K及PEG2K溶于二氯甲烷，加入丁二酸酐及DMF，加熱回流12 h;旋轉蒸干后，加入乙酸乙酯重結晶2次，沉淀析出時抽濾，濾餅晾干得羧化PEG;將羧化PEG溶于二氯甲烷，加入草酰氯，回流反應12 h，旋轉蒸干得PEG酰氯。將β谷甾醇溶于二氯甲烷，加入丁二酸酐及DMF，加熱回流12 h。旋干，加入蒸餾水攪拌，抽濾，濾餅干燥得羧化β谷甾醇;將羧化β谷甾醇溶于二氯甲烷，加入草酰氯，回流反應12 h，旋干，即得β谷甾醇酰氯。將殼聚糖溶于甲烷磺酸，先后加入β谷甾醇酰氯與PEG酰氯，50℃攪拌2 h，冰浴下加入適量蒸餾水終止反應，混合液轉入透析袋(截留相對分子質量3 500)透析至中性，抽濾，濾液凍干，即得PSC。

空白和載香豆素－6的PSC納米粒:取適量PSC樣品，分散于水中，室溫攪拌2 h，冰浴下以脈沖式超聲儀超聲20 min(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，即得空白PSC納米粒懸液。取適量PSC與香豆素－6，溶解于乙醇中，攪拌30 min，裝入透析袋(截留相對分子質量3 500)透析12 h，即得載香豆素－6的PSC納米粒懸液。

2.2 臨界聚集濃度(CAC)測定

采用穩態熒光探針法，考察PSC納米粒在水溶液中的CAC。將PSC分散于水中，超聲溶解，稀釋至不同質量濃度(1.0×10－3～1.0 ×10－1g/L)，備用。精密量取 50 μL 芘的甲醇溶液(6.0 ×10－4mol/L)，置5 mL容量瓶中，氮氣吹干。精密量取5 mL不同濃度的納米粒懸液，分別加至吹干的容量瓶中，超聲1 h。激發波長λex=337 nm，激發波長狹縫寬度5 nm，發射波長狹縫寬度10 nm，以熒光分光光度計記錄各樣品的發射光譜。以樣品在發射波長為384 nm和373 nm波長處熒光強度的比值 I384/I373對樣品質量濃度 C(g/L)的對數值logC作圖，計算PSC納米粒的CAC值。結果見圖1。芘是一種脂溶性熒光探針，在極性環境中的熒光極弱，而在非極性環境中的熒光很強，故當水中有納米粒或疏水結構域生成時，芘分子自發由水相向疏水結構域轉移，其熒光強度顯著增加。由圖 1 可見，在低質量濃度時，PSCI384/I373值為 1.9～2.2，與芘在水中的比值接近，且變化不大;當質量濃度逐漸增大時，I384/I373突然降低，變化的轉折點所對應的質量濃度為PSC的CAC。計算得PSC的CAC值為0.02 g/L，低于許多兩親性小分子物質的臨界膠束濃度。

2.3 載藥量與包封率測定

圖1 芘發射光譜 I384/I373與PSC質量濃度的關系

精密稱取一定量的PSC與香豆素－6(質量為 M0)，溶解于乙醇中，攪拌30 min，裝入透析袋(截留相對分子質量3 500)透析12 h，將得到的載香豆素－6的PSC納米粒懸液用0.45 μm微孔濾膜過濾，精密測定濾液體積 V。取0.5 mL濾液，與4.5 mL甲醇混勻，超聲5 min，12 000 r/min，離心10 min，上清液用熒光分光光度計測定香豆素－6的熒光強度，根據標準曲線得到香豆素－6濃度 C。另取1 mL濾液，冷凍干燥后精密稱定質量 M。計算載藥量(loading capacity，LC)和包封率(encapsulation efficiency，EE)，LC(%，w/w)=[(C×V×10)/(M×V)]×100%，EE(%，w/w)=[(C×V×10)/M0]×100%。結果PSC納米粒對香豆素－6的包封率為75%，載藥量為3.3%，表明透析法可有效將香豆素－6載入納米粒內核。

2.4 PSC納米粒體外釋放行為考察

以疏水性熒光物質香豆素－6為模型藥物，采用透析法制備載香豆素－6的PSC納米粒，以pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)為釋放介質，考察其體外釋放行為。

標準曲線繪制:將香豆素－6稀釋成質量濃度分別為0.024 4，0.012 2，0.006 1，0.004 1，0.003 1，0.001 5，0.001 2 μg/mL 的甲醇溶液，采用熒光分光光度計(λex=446 nm，λem=510 nm，λex和λem的狹縫寬度均為10 nm)測定不同質量濃度香豆素－6溶液的熒光強度，繪制標準曲線，線性回歸方程為 Y=169 991 X+7.26，R2=0.999 7(n=7)。結果表明，香豆素 －6 質量濃度在0.001 2～0.024 4 μg/mL范圍內與熒光強度呈良好線性關系。

方法專屬性考察:在相同條件下(λex=446 nm，λem=510 nm，λex和λem的狹縫寬度均為10 nm)，用熒光分光光度計檢測空白PSC納米粒溶液與釋放介質，考察對香豆素－6的測定是否有干擾。結果在相同熒光光度計測定條件下，PSC空白納米粒及釋放介質PBS對香豆素－6的測定無干擾。

釋放度測定與釋放曲線繪制:采用透析法漏槽條件考察載藥膠束的體外釋放情況。將載香豆素－6的PSC納米粒溶液裝入透析袋(截留相對分子質量3 500)，再浸入裝有PBS(pH=7.4)100 mL的燒杯中，置恒溫振蕩器中，37℃，100 r/min振搖。分別于 15 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h 時將釋放介質全部取出，更換新鮮的PBS 100 mL;同時，從取出的100 mL釋放介質中精密吸取10 mL，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次的有機層，旋轉蒸發器揮干溶劑，殘渣用5 mL甲醇溶解后用熒光分光光度計檢測。根據標準曲線計算出每個時間點的釋放量，得累積釋放量及累積釋放率，以時間為橫坐標、累積釋放率為縱坐標作香豆素－6的釋放曲線圖，見圖2。可見，載香豆素－6的PSC納米粒在30 min累積釋放率約為23%，4 h約為56%，8 h約為68%，24 h約為98%，呈現出先突釋后緩釋的特點，具有一定的緩釋能力。

2.5 載藥PSC納米粒組織分布考察

圖2 載香豆素－6的PSC納米粒釋放曲線圖(n=3)

藥品準備:將100 mg PSC1K溶于2.5 mL乙醇中，并加入5 mg香豆素，攪拌30 min，裝入10 cm的透析袋中(截留相對分子質量3 500)，透析12 h，過濾，冷凍干燥，取干燥品配成質量濃度為5 g/L的溶液。載藥PSC2K納米粒的處理方法相同。

給藥設計及樣本制作:取昆明小鼠18只(雌性，平均體重為18 g)，隨機分為6組，每組3只。前3組小鼠尾靜脈注射載藥PSC1K納米粒溶液0.3 mL，后3組小鼠尾靜脈注射載藥PSC2K納米粒溶液0.3 mL。于給藥后1，4，8 h摘眼球取血，置以1%肝素抗凝的EP管中。隨即頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出心、肝、脾、肺、腎、腦，生理鹽水洗去殘余血液，去除多余結締組織，濾紙吸干，稱重后裝入EP管。所有樣品均置冰箱內保存，備用。

樣本處理與檢測:取各組織樣品0.1 g(不足0.1 g的按實際質量)，加0.7 mL生理鹽水勻漿;勻漿液中加入2.8 mL甲醇，渦旋5 min，14 000 r/min離心 10 min;取上清0.2 mL用甲醇稀釋10倍后熒光分光光度計檢測。

標準曲線繪制:配置質量濃度為 0.001～0.03 μg/mL 的香豆素甲醇溶液，用熒光分光光度計測定不同溶液的熒光強度。以香豆素甲醇溶液質量濃度對熒光強度進行線性回歸分析，繪制標準曲線。香豆素線性回歸方程為 Y=299 680X+94.672，R2=0.999 4。

組織分布:PSC1K溶液和PSC2K溶液經小鼠尾靜脈注射后，以不同時間各組織中香豆素－6的含量來評價制劑在小鼠體內的組織分布。結果見圖3。可見，PSC1K納米粒尾靜脈注射后，在各個組織的分布量于1 h達峰值，之后隨著時間的延長藥物分布量呈下降趨勢。給藥1 h時，各組織中肺的藥物分布量最高，其次是肝、脾;PSC2K納米粒尾靜脈注射后，在各組織的分布量在1 h達峰值，之后隨時間的延長藥物分布量呈下降趨勢。給藥1 h時，各組織中心的藥物分布量最高，而在2 h時心的藥物分布量迅速降低。

圖3 納米粒小鼠體內的組織分布直方圖

3 討論

由圖1可見，本試驗中合成的PSC具有較小的CAC值，說明PSC納米粒具有較強的勢力學穩定性。用藥時，即使被血液稀釋到很低的濃度，依然能保持納米粒結構，避免了藥物的泄漏，保障了用藥安全。

PSC1K溶液和PSC2K溶液經小鼠尾靜脈注射，以不同時間各組織中香豆素－6的含量來評價制劑在小鼠體內的組織分布，了解載藥PSC1K納米粒及載藥PSC2K納米粒小鼠體內的組織分布情況(圖3)。本試驗發現，PSC1K納米粒尾靜脈注射后，在各個組織的分布量在1 h達峰值，之后隨著時間的延長呈下降趨勢;給藥1 h時，各組織中肺的藥物分布量最高，其次是肝、脾。這可能是由于PSC納米粒帶正電，與肺黏膜表面的負電荷基團相互作用，導致肺中藥物分布量較高。肝、脾作為單核細胞吞噬系統的主要器官，對注射入體內的微小粒子具有吞噬作用，因此這兩個組織中藥物分布量也較高。腎與心的藥物分布量很低，表明PSC納米粒給藥不會造成腎毒性和心臟毒性。與此同時，PSC2K納米粒尾靜脈注射后，與PSC1K相似，在各個組織的分布量在1 h達峰值，之后隨著時間的延長呈下降趨勢;給藥1 h時，各組織中心的藥物分布量最高，而在2 h時心臟的藥物分布量迅速降低，這可能是由于殘留在心臟的血液未被清洗干凈，而血中的藥物分布量較高所致。PSC2K在肺、肝、脾中的分布量較高，但與PSC1K相比，其被肝、脾攝取的量下降，這可能是因為PSC2K修飾了更長的PEG鏈，對避免被單核細胞吞噬系統吞噬具有更強的保護作用。值得注意的是，PSC2K與PSC1K相比，在腦部的藥物分布量顯著提高，一方面可能是由于PSC2K的循環時間更長，另一方面可能相對分子質量為2 000的PEG更容易與血腦屏障的細胞膜融合而使納米粒跨血腦屏障。

總之，本試驗成功地考察了新型兩親性殼聚糖衍生物PSC在水中自組裝形成納米粒的性能及組織分布。PSC作為一種新型的載藥膠束，在水中可自組裝成納米粒;臨界聚集濃度為0.02 g/L，具有較強的穩定性;載藥量為3.3%，包封率為75%，能夠有效包載香豆素，顯著增加其溶解度。載香豆素－6的PSC納米粒在30 min累積釋放率約為23%，4 h約為56%，8 h約為68%，24 h累積釋放率約為98%，表現為先突釋后緩釋的特點，具有一定的緩釋能力。載藥PSC納米粒在肺部濃度較高，可能由于其荷正電與負電性的肺黏膜相互作用造成;由于巨噬細胞的吞噬在肝、脾中濃度也較高，修飾較長鏈的PEG可減少被肝、脾的吞噬;同時，修飾較長鏈PEG的納米粒比修飾短鏈PEG的納米粒在腦部的分布有所增加;兩種PSC納米粒在腎、心中分布均較少。上述結果表明，PSC膠束作為疏水性的抗癌藥物載體，具有良好的發展前景。

[1]吉順莉，張春燕，戈延茹.納米載藥系統的研究進展[J].中國藥業，2010，19(14):82 － 83.

[2]蔣挺大.殼聚糖[M].第2版.北京:化學工業出版社，2006:12.

[3]Liu WG，Sun SJ，Zhang X，et al.Self－ aggregation behavior of alkylated chitosan and its effect on the release of a hydrophobic drug[J].J Biomater Sci Polymer Edn，2003，14(8):851 － 859.

[4]Liu CG，Desai KGH，Chen XG，et al.Linolenic acid － modified chitosan for formation of self－ assembled nanoparticles[J].J Agric Food Chem，2005，53(2):437－441.

[5]Zhang J，Chen XG，Li YY，et al.Self－ assembled nanoparticles based on hydrophobically modified chitosan as carriers for doxorubicin[J].Nanomedicine，2007，3(4):258 － 265.

[6]Lee KY，Jo WH，Kwon IC，et al.Structural determination and interior polarity of self－aggregates prepared from deoxycholic acid－modified chitosan in water[J].Macromolecules，1998，31(2):378 － 383.

[7]Wang YS，Liu LR，Jiang Q，et al.Self－aggregated nanoparticles of cholesterol－modifiedchitosan conjugate as a novelcarrier of epirubicin[J].Eur Polym J，2007，43(1):43 － 51.

[8]Kim K，Kwon S，Park JH，et al.Physicochemical characterizations of self－assembled nanoparticles ofglycolchitosan－deoxycholic acid conjugates[J].Biomacromolecules，2005，6(2):1 154 － 1 158.

[9]Park JH，Kwon S，Nam JO，et al.Self－ assembled nanoparticles based on glycol chitosan bearing 5β － cholanic acid for RGD peptide delivery[J].J Control Release，2004，95(3):579 － 588.

[10]Zhang C，Ping QN，Zhang HJ，et al.Preparation of N －alkyl－O －sulfate chitosan derivatives and micellar solubilization of taxol[J].Carbohyd Polym，2003，54(4):137 － 141.

[11]Sajeesh S，Sharma CP.Novel pH responsive polymethacrylic acid － chitosan － polyethylene glycol nanoparticles for oral peptide delivery[J].J Biomed Mater Res B，2006，76B(2):298 － 305.