帕金森病患者腦脊液中miR-9a的表達及其臨床意義

張 宏朱政峰李 輝

（1 蘭州軍區空軍機關醫院神經內科，甘肅 蘭州 730000；2 蘭州軍區空軍機關醫院醫務處，甘肅 蘭州 730000）

帕金森病患者腦脊液中miR-9a的表達及其臨床意義

張 宏1朱政峰2李 輝1

（1 蘭州軍區空軍機關醫院神經內科，甘肅 蘭州 730000；2 蘭州軍區空軍機關醫院醫務處，甘肅 蘭州 730000）

目的研究miR-9a在帕金森病（PD）患者腦脊液中的表達，為帕金森病的早期診斷提供臨床檢測指標。方法采用實時熒光定量PCR檢測42例PD患者、24例普通頭痛患者和24例健康人腦脊液中miR-9a表達水平情況。分析腦脊液中miR-9a表達水平與PD相關臨床指標的關系。結果PD組患者腦脊液中miR-9a表達水平明顯高于頭痛組和健康對照組（P<0.05），且PD患者腦脊液中miR-9a表達與帕金森綜合評分量表（UPDRS）分級呈正相關（r=0.70，P<0.05）。ROC曲線確診PD患者的腦脊液miR-9a臨界值為0.667，其診斷敏感度為85.7%，特異度為77.9%。結論腦脊液miR-9a的檢測不僅有助于PD的診斷，也可能作為判斷PD病情的指標之一。

帕金森病；腦脊液；miR-9a；生物標志物

帕金森病（Parkinson disease，PD）是以黑質紋狀體系統多巴胺能神經元進行性變性缺失和Lewy小體出現為特異性改變，好發于中老年人，其病因和發病機制至今尚未完全明確[1]。流行病學調查顯示，我國50 歲以上人群中 PD 的患病率約為1%。由于PD患者可出現嚴重的運動功能障礙，如震顫、強直及動作遲緩，嚴重者生活不能自理，給社會和家庭帶來沉重的負擔[2]。目前臨床上對于PD的診斷只能依靠患者臨床癥狀，而當患者出現明顯的臨床癥狀時，神經元損害往往已經達到了不可代償的階段。因此，尋找一種可靠的、能早期診斷并跟蹤疾病進展的生物標志物，已成為目前研究PD的熱點。最近的研究表明，人的體液中存在穩定表達的miRNAs。且PD患者腦脊液中miRNAs的表達與正常人存在比較明顯的差異[3]。有報道腦組織中miR-9a的表達與神經系統發育和神經系統相關疾病密切相關。但腦脊液miR-9a能否作為PD診斷及病情評估的標志物尚不清楚。本研究通過檢測PD患者腦脊液中的表達水平，探討miR-9a在PD的臨床診斷中的應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象：選取2009年10月至2013年10月在我院神經內科住院的42例原發性PD患者為PD組。所有PD 患者的診斷均符合全國錐體外系疾病討論會制定的PD診斷標準，并且排除其他腦變性疾病。UPDRS分級Ⅰ～Ⅲ。其中男性26例，女性16例；年齡57～77歲，平均（64.6 ±7.8）歲；病程2～6年。頭痛組為24例主訴頭痛患者，均排除腦血管疾病、神經系統感染和腫瘤等器質性病變。其中男性9例，女性15例，平均年齡（55.4±7.2）歲。健康對照組為24例健康人，其中男性12例，女性12例，平均年齡（50.7±6.4）歲。所有受試者及其家屬均被明確告知且簽署知情同意書。

1.2 主要設備和試劑：Trizol 試劑（Invitrogen公司）；TaqMan MicroRNA Assay和mirVana? miRNA Isolation Kit（Ambion公司）；ABI PRISM 7900 實時熒光定量PCR儀（ABI公司）；NanoDrop? ND-3300微量分光光度儀（ThermoFisher公司）；miR-9a及U6引物序列購于北京天根生物工程有限公司。

1.3 腦脊液采集：所有受試者均采取腰椎穿刺的方式收集腦脊液。患者取側臥位，在局麻下行腰椎穿刺，經檢測顱內壓無升高或降低，椎管無阻塞后。取無色清亮腦脊液約5～6 μL，室溫下1500 rpm/min離心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱待測。

1.4 RT-PCR：①Trizol法提取腦脊液RNA，NanoDrop? ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計測定RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。mirVana? miRNA Isolation Kit總RNA中分離出miRNA。②cDNA合成：按RT-PCR反應試劑盒操作步驟制備10 μLRT反應體系：mirVana5×RT Buffer 2 μL，1×mirVanaRT Primer 1 μL，Arrayseript Enzme Mix 0.4 μL，25 ng RNA，加無RNA酶水至總體積10 μL。在GeneAmp PCR System 9700進行逆轉錄反應：16 ℃ 30 min， 42 ℃ 30 min，83 ℃ 5 min。反應結束后，冰浴冷卻，-80 ℃保存。③Realtime PCR反應：采用TaqMan MicroRNA Assays，以U6為內參基因，建立20 μL反應體系：Product from RT reaction 1.33 μL，Taqman MicroRNA Assay（20×）1 μL，Taqman 2×Universal PCR Master Mix 10 μL，Nuclease-free water 7.67 μL。反應條件：95 ℃ 10 min，（95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s）共40個PCR循環。采用2-ΔΔCT法分析miR-9a表達相對水平情況。

1.5 統計學處理：應用SPSS 13.0統計學軟件包對數據進行統計分析。采用采用獨立樣本t檢驗，Sperman等級相關分析評估腦脊液miR-9a表達水平與UPDRS分級之間的相關性，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組腦脊液miR-9a表達水平比較：健康人腦脊液中miR-9a表達水平較低（0.25±0.04）；頭痛組腦脊液中miR-9a表達水平為（0.26± 0.07），與健康組相比無明顯差異（P>0.05）。PD組患者腦脊液中miR-9a表達水平相對值為（1.38±0.37），明顯高于健康對照組和頭痛組（P<0.05）（圖1）。

圖 1 不同組腦脊液miR-9a表達水平

2.2 腦脊液miR-9a表達情況在診斷PD上的效能評價：以腦脊液中miR-9a表達水平相對值為檢測變量，以分組為狀態變量，建立ROC曲線。結果顯示，腦脊液miR-9a診斷PD的ROC曲線下面積AUC為0.815。通過計算確定miR-9a診斷PD的最佳臨界值為0.667，在此臨界值下的診斷敏感度為85.7%，特異度為77.9%（圖 2）。

圖 2 ROC曲線

2.3 腦脊液miR-9a與PD組各因素之間的相關性分析：由表1可見，Sperman相關性分析顯示PD患者腦脊液miR-9a水平與年齡、病程無相關性（P>0.05），而與UPDR分級呈正相關（P<0.05）。

表1 miR-9a與PD組各因素相關性分析

3 討 論

PD的發病機制十分復雜，目前尚不十分清楚，可能主要由于黑質-紋狀體多巴胺能神經通路變性和Lewy小體的形成導致DA能神經元減少。由于PD發病隱匿，早期腦組織無明顯影像學改變，待神經功能障礙癥狀時病變損害已不可逆轉。因此，早期診斷對于PD的治療具有非常熏要的臨床意義。

目前的研究證實，腦脊液的生化改變能夠反映大腦病理改變，因而在診斷神經變性疾病方面較血清學更具敏感性和特異性。且由于受腦組織取材的限制，因此通過檢測腦脊液中PD相關生物學標志物是早期診斷PD的最佳途徑[4]。近年來，腦脊液中PD相關生物學標志物的研究已取得較大的進展。如黃嘌呤、尿酸、β2苯乙胺、α-Synuclein蛋白、超氧化物歧化酶等腦脊液分子生物學指標都被證實與PD的發生有關，且有成為PD生物標志物的潛能[5]。但是，以上標志物在診斷PD的敏感度和特異度上尚存在不足。

miR-9a是近年來發現的在哺乳動物腦組織中高度表達的miRNA，且其核苷酸100%保守。研究發現miR-9a在果蠅感覺器官前體細胞（SOP）中表達極其低下而在其臨近上皮細胞中呈高表達。提示miR-9a可能對感覺神經元發育成熟和功能加以調控。且miR-9a可以通過調控SOP向感覺神經元分化過程中必需的轉錄因子，進而使SOP細胞向感覺神經細胞分化[6]。最近Lukiw研究發現阿爾茨海默病（AD）患者海馬內miR-9表達水平明顯上調[7]。以上研究提示miR-9a與神經系統地發育和疾病的發生密切相關。因此，miR-9a在腦脊液的研究可能有利于為我們闡明PD的具體發病機制，也為早期診斷PD提供了一個潛在的標志物。

本次研究我們采用RT-PCR檢測PD患者、頭痛患者和健康人腦脊液中miR-9a表達水平，發現PD患者腦脊液中miR-9a表達水平明顯高于頭痛組和健康對照組（P<0.05）。同時，我們利用ROC曲線確定了腦脊液中miR-9a在診斷PD上的效能，發現腦脊液miR-9a診斷PD的ROC曲線下面積AUC為0.815。通過計算確定miR-9a診斷PD的最佳臨界值為0.667，且在此臨界值下的診斷敏感度為85.7%，特異度為77.9%。提示腦脊液中miR-9a的高表達可以作為PD的診斷指標，且具有較高敏感度和特異度。此外，通過Sperman等級相關分析，PD患者腦脊液中miR-9a表達水平與患者年齡、病程無相關性（P>0.05），而與UPDR分級呈正相關（P<0.05）。提示可以通過檢測PD患者腦脊液中miR-9a表達水平來推測PD損傷程度。

綜上，本次研究結果提示腦脊液miR-9a可能成為新的PD診斷及判斷病情的標志物，其具有較高敏感度和特異度。隨著對miRNA在神經疾病領域內的研究，miRNA將會成為PD疾病一個新的診斷和治療靶點。

[1] Dexter DT,Jenner P.Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms[J].Free Radic Biol Med,2013,62(1):132-144.

[2] 帕金森病診療指南[J].中國臨床醫生,2010,38(2):77-79.

[3] Machida A,Ohkubo T,Yokota T.Circulating microRNAs in the cerebrospinal fluid of patients with brain diseases[J].Methods Mol Biol,2013,1024(1):203-209.

[4] Shi M,Bradner J,Hancock A M,et al.Cerebrospinal fluid biomarkers for Parkinson disease diagnosis and progression[J].Ann Neurol, 2011,69(3):570-580.

[5] Ascherio A,Lewitt P A,Xu K,et al.Urate as a predictor of the rate of clinical decline in Parkinson disease[J].Arch Neurol,2009,66 (12):1460-1468.

[6] Li Y,Wang F,Lee J A,et al.MicroRNA-9a ensures the precise specification of sensory organ precursors in Drosophila[J].Genes Dev, 2006,20(20):2793-2805.

[7] Lukiw W J.Micro-RNA speciation in fetal,adult and Alzheimer's disease hippocampus[J].Neuroreport,2007,18(3):297-300.

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1671-8194（2014）36-0166-02