登革2型病毒NS3蛋白具有抑制病毒復(fù)制的作用

朱碧青，鄭學(xué)禮

登革熱是由登革病毒（DENV）引起的一種嚴重的蟲媒病毒性傳染病，主要在熱帶、亞熱帶地區(qū)流行［1］。據(jù)報道，全球約有25億人受到登革熱感染的威脅［2］。然而目前尚無特異有效的登革疫苗和抗病毒制劑［3］。

登革病毒屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus），其基因組為單股正鏈RNA，長約11 kb，共編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM、E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋 白 （NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5）［4］。其中NS3蛋白是一種親水性的多功能蛋白，分子量（Mr）約為69kDa，含618個氨基酸，具有蛋白酶、RNA解旋酶和RNA聚合酶活性，在病毒的復(fù)制和成熟過程中起作用［5］。NS3蛋白含有蛋白酶和解旋酶兩個結(jié)構(gòu)域，具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生B、T細胞應(yīng)答［6］。已有研究表明，NS3蛋白在病人和受試者體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的免疫反應(yīng)，登革病毒NS3已成為有效的抗病毒靶標［7］。本研究目的在于構(gòu)建DENV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3及其結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，并對其活性作初步鑒定，為登革疫苗的研制打下實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株、質(zhì)粒及細胞 DENV-2（新幾內(nèi)亞株）和大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。載體pcDNA3.1（＋）由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗室所贈。幼倉鼠腎細胞（BHK-21）為本實驗室保存。

1.2 試劑 Trizol和Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自美國 Omega Bio-Tec公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、PFU聚合酶、快速限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、pMD 18-T Vector試劑盒、實時定量PCR試劑盒等均購自大連TaKaRa公司；抗NS3兔多克隆抗體（SAB2700181）購自德國的Sigma公司；FITC標記的羊抗兔IgG和HRP標記的羊抗兔IgG均為SantaCruz公司產(chǎn)品；PVDF膜、Electrochemiluminescence（ECL）試劑盒均購自Bio-Rad公司。

1.3 目的基因的擴增 根據(jù)DENV-2NGC病毒株基因組序列（GenBank：NC-001474）設(shè)計引物如下：擴增非結(jié)構(gòu)蛋白NS3及其結(jié)構(gòu)域NS3P、NS3H的基因序列（圖1）。使用pfu聚合酶進行PCR擴增：94℃2min；然后以92℃1min、55℃1min、72℃2min進行30個循環(huán)，再72℃延伸5min。

圖1 DENV-2-NS3、DENV 2-NS3蛋白酶（NS3P）區(qū) 域 及DENV-2-NS3解旋酶（NS3H）區(qū)域結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic representation of DENV 2-NS3，NS3Pand NS3H

1.4 重組表達載體的構(gòu)建 用快速性內(nèi)切酶EcoR V和XbaI分別雙酶切真核表達載體pcDNA3.1（＋）和PCR產(chǎn)物，分別使用凝膠回收試劑盒及產(chǎn)物純化試劑盒回收純化目的片段，于4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨機挑取克隆，經(jīng)菌液PCR篩選陽性克隆，送Invitrogen公司測序，將讀碼框正確的重組質(zhì)粒命名為pcNS3P、pcNS3H和pcNS3（見表1）。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，紫外分光光度計（Nanodrop2000）測定濃度用于轉(zhuǎn)染。

表1 登革病毒NS3蛋白酶、解旋酶和全長的引物序列Tab.1 Primers of NS3protease，NS3helicase and NS3full-length

1.5 轉(zhuǎn)染 2×104個/孔的BHK-21細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中，待細胞在6孔板中長滿單層時，將4μg重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）分別與10μL Lipo2000混合，轉(zhuǎn)染細胞，于37℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)，于24h、36h、48h和72h分別收集細胞用于鑒定重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染水平。

1.6 RT-PCR 采用Trizol法提取轉(zhuǎn)染細胞的總RNA，經(jīng) DNaseI處 理 后，通 過 RT-PCR 檢 測NS3P、NS3H和NS3基因在BHK-21細胞中的轉(zhuǎn)錄。PCR擴增NS3蛋白酶、解旋酶和全長基因的循環(huán)條件為：94℃2min；然后以92℃1min、55℃1 min、72℃2min進行25個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.7 間接免疫熒光 轉(zhuǎn)染后24h的單層細胞用0.1mol/L、pH 7.4的PBS漂洗兩次，用4%多聚甲醛固定10min后，用0.6%皂素透化10min。其后用1%BSA封閉30min。以SAB2700181（稀釋度1∶500）為一抗、FITC標記的羊抗兔（1∶100稀釋度）為二抗進行間接免疫熒光檢測。

1.8 Western印跡 轉(zhuǎn)染后48h收集細胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌兩次后，提取細胞總蛋白。將總蛋白定量后溶解于1×上樣緩沖液中，煮沸5min后，離心，經(jīng)12%SDS-PAGE分離；用半干轉(zhuǎn)移印將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h；以1∶1 000稀釋的Anti-NS3（SAB2700181）為一抗，室溫孵育2.5h，用 TBST洗膜6次，每次5min；以1∶8 500稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，于室溫孵育1h；用TBST洗膜6次，每次5min；ECL顯色。

1.9 病毒感染和Real-time PCR反應(yīng)體系 將轉(zhuǎn)染6h后的細胞，棄去 轉(zhuǎn)染液，用 DENV－2（MOI＝1）攻擊細胞，96h后收集細胞，用Trizol試劑提取各組BHK-21細胞的RNA，具體步驟詳見說明書及相關(guān)文獻。提取的總RNA（1ug）經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，備用于實時熒光定量PCR（QPCR）分析。QPCR反應(yīng)體系和條件按說明書進行相關(guān)操作。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，30s，變性95℃、5s，退火55℃、30s，延伸72℃、30s，擴增40個循環(huán)，并收集溶解曲線。BHK-21分為以下3個組：實驗組：質(zhì)粒pcNS3P、pcNS3H和pcNS3轉(zhuǎn)染，病毒攻擊；空白對照組：質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）轉(zhuǎn)染，病毒攻擊；陽性對照組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，病毒攻擊。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用One-Way ANOVA的多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達載體的構(gòu)建與鑒定 以登革2型NGC株病毒全長cDNA克隆載體為模板進行擴增，可分別獲得555bp、1 299bp和1 854bp的DNA片段（圖2），與預(yù)期的NS3P、NS3H 和NS3基因大小一致。經(jīng)同樣雙酶切的PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1（＋）進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后經(jīng)菌液PCR篩選陽性克隆。測序結(jié)果表明，插入片段序列分別與NS3P、NS3H和NS3完全一致，并以正確的讀碼框插入表達載體。

2.2 重組pcNS3P、pcNS3H和pcNS3蛋白的表達與鑒定 采用Lipo2000將重組載體及pcDNA3.1（＋）轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后，首先在RNA水平檢測NS3P、NS3H和NS3基因的轉(zhuǎn)錄。為避免質(zhì)粒污染，提取轉(zhuǎn)染48h后的細胞總RNA后，經(jīng)DNase I處理后，用蛋白酶及解旋酶的兩對引物進行RTPCR。結(jié)果可獲得分別與NS3H和NS3P大小一致的基因片段。未轉(zhuǎn)染組及空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組則不能獲得目的條帶。（圖3）這說明重組質(zhì)粒pcNS3P、pc-NS3H和pcNS3可在BHK-21細胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生NS3及其結(jié)構(gòu)域基因的mRNA。

圖2 登革2型病毒NS3P、NS3H和NS3基因的擴增M：DL2000；1：NS3P基因擴增產(chǎn)物；2：NS3H 基因擴增產(chǎn)物；3：NS3基因擴增產(chǎn)物Fig.2 Products of DEN-V 2-NS3P，NS3Hand NS3by PCRM：Marker DL2000；Lane 1：Product of DENV 2-NS3P；Lane 2：Product of DENV 2-NS3H；Lane 3：Product of DEN-V 2-NS3.

圖3 RT-PCR檢測NS3P、NS3H和NS3基因在BHK-21細胞中的轉(zhuǎn)錄M：DL2000；1和12：未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的總 RNA；2、4和7：轉(zhuǎn)染pcNS3的細胞總RNA；3和6：轉(zhuǎn)染pcNS3H的細胞總RNA；5和10：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（＋）的細胞總 RNA；9和11：轉(zhuǎn)染pcNS3P的細胞總RNAFig.3 Level of transcription of NS3P，NS3Hand NS3gene in BHK-21cells by RT-PCRM：Marker DL2000；Lane 1and 12：The transcription of total RNA without transcription；Lane 2，4 and 7：The transcription of total RNA with pcNS3 recombination plasmid；Lane 3and 6：The transcription of total RNA with pcNS3Hrecombination plasmid；Lane 5and 10：The transcription of total RNA with pcDNA3.1（＋）plasmid；Lane 9and 11：The transcription of total RNA with pcNS3Precombination plasmid.

為進一步觀察登革2型NGC株非結(jié)構(gòu)蛋白NS3及其結(jié)構(gòu)域在BHK-21細胞中的表達情況，我們于轉(zhuǎn)染24h后收集細胞，采用抗登革2型病毒NS3多克隆抗體作為一抗，進行間接免疫熒光檢測。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染24h、36h、48h和72h后，可在細胞質(zhì)中觀察到吸附有特異綠色熒光顆粒的物質(zhì)，這說明NS3、NS3H和NS3P已在BHK-21細胞中表達（圖4）。轉(zhuǎn)染48h后提取細胞總蛋白進行SDS-PAGE，將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以Anti－NS3為一抗進行Western印跡，結(jié)果存在相對分子量約為69kDa、50kDa及18kDa的特異蛋白（圖5），與 DENV2-NS3、DENV2-NS3H 和 DENV2－NS3P蛋白的預(yù)測大小相吻合。

圖4 間接免疫熒光檢測NS3P、NS3H和NS3在BHK-21細胞中的表達（瞬時轉(zhuǎn)染24h，400×）A為NS3P的表達；B為NS3H的表達；C為NS3的表達；D為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（＋）Fig.4 Immunofluorescence of BHK-21cells transfected with recombinant plasmids based on NS3functional domains（Magnification 400×）A：NS3P；B：N3P；C：NS3；D：pcDNA3.1（＋）.

2.3 Real-time PCR 探討重組 pcNS3、pcNS3H 及pcNS3P在細胞胞內(nèi)對DENV復(fù)制的抑制效果 收集經(jīng)DENV-2型NGC病毒株攻擊72h的各轉(zhuǎn)染實驗組、未轉(zhuǎn)染組及空白對照組的BHK-21細胞，應(yīng)用QPCR檢測各組細胞內(nèi)病毒載量的變化。圖6顯示：轉(zhuǎn)染pcNS3、pcNS3H組均與空白對照組及未轉(zhuǎn)染組間的病毒載量存在著差異（P＜0.05），空白對照組與未轉(zhuǎn)染組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染pcNS3P組雖與未轉(zhuǎn)染組及空白對照組間有量的變化，但之間的差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 Western印記檢測NS3P、NS3H和NS3蛋白在BHK-21細胞中表達M：蛋白Marker；1：轉(zhuǎn)染pcNS3H的細胞總蛋白；2和4：轉(zhuǎn)染pcNS3的細胞總蛋白；3：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（＋）的細胞總蛋白；5：轉(zhuǎn)染pcNS3P的細胞總蛋白。箭頭為所指目的蛋白條帶Fig.5 Protein of NS3P，NS3Hand NS3of DEN-V II in BHK-21by Western blotM：Marker；Lane 1：Total proteins of cells with transcription；Lane 2and 4：Total proteins of cells with pcNS3；Lane 3：Total proteins of cells with pcDNA3.1 （＋）；Lane 5：Total proteins of cells with pcNS3P.

圖6 實時熒光定量PCR比較分析重組蛋白對登革2型病毒的調(diào)控（抑制）水平 （＊表示差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，＊＊＊，P＜0.001；＊，P＜0.05）Fig.6 Regulation for virus replication of recombination proteins of DENV-2with QPCR

3 討 論

登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3，具有疏水性，在黃病毒中有很高的保守性［9］，具有若干個T細胞表位［10］。已有試驗表明，NS3蛋白在病人和受試者體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的免疫反應(yīng)。為深入了解NS3在登革病毒致病過程中的作用機制，我們首先在哺乳細胞BHK-21中表達了DENV-2-NGC病毒株的NS3蛋白及其結(jié)構(gòu)域，并對其活性作了初步的探究。

NS3蛋白由N端185個氨基酸殘基的蛋白酶及C端433個氨基酸殘基的解旋酶兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成［11－12］。NS3蛋白 N 端前180氨基酸含有絲氨酸蛋白酶區(qū)域，其前167氨基酸是DEN-V-2蛋白水解活性所需的最少殘基數(shù)［13－14］，剩余的C端含有3個酶活性的區(qū)域：NTP酶、RNA解螺旋酶和RTP酶，所以NS3蛋白對病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制起著極其重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)pcNS3及pcNS3H重組質(zhì)粒可在哺乳細胞內(nèi)對登革病毒的復(fù)制具有一定的抑制作用。最近研究發(fā)現(xiàn)日本腦炎病毒中NS3蛋白區(qū)域和NS3解螺旋酶區(qū)域會啟動細胞死亡程序［15］，而日本腦炎病毒和登革病毒同屬黃病毒家族，都經(jīng)過蚊媒傳播。另外，在Langet病毒，一種蜱傳播的腦炎黃病毒家族中，其NS3蛋白也需要結(jié)合半胱天冬酶-8引起細胞凋亡［16］。所以，登革病毒的NS3蛋白和NS3H也有可能是通過啟動細胞死亡程序來減少病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制。NS3蛋白N端前180氨基酸含有絲氨酸蛋白酶區(qū)域，這個區(qū)域要發(fā)揮作用，需要病毒NS2B區(qū)域的活性［17］，故而轉(zhuǎn)染pcNS3P的重組質(zhì)粒的BHK-21細胞對登革病毒的復(fù)制沒有明顯的抑制作用。

本研究缺陷在于 Western檢測（圖5）的NS3、NS3P和NS3H蛋白的特異性條帶尚不清楚，原因為使用的是DENV-2-NS3的多克隆抗體進行檢測，致使目的條帶不特異，但蛋白的分子量符合大小。本實驗后期在各蛋白下游加His-Tag標簽蛋白，使用特異性抗體的針對His-Tag的蛋白進行檢測。

綜上所述，NS3蛋白區(qū)域具有一定的抗病毒作用，但這種作用主要集中在NS3H區(qū)域，而需要NS3P區(qū)域發(fā)揮抗病毒作用，可能需要NS2B區(qū)域的共同作用，這為我們進一步研究登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3基因疫苗提供一定的策略［18］。

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