白紋伊蚊唾液腺serpin1基因的可變剪接分析與原核表達

程金芝，孫 宇，陳 璐，劉 鑒，吳家紅

白紋伊蚊是一種重要的醫學昆蟲，吸血不僅造成宿主嚴重的過敏反應，而且還可以傳播多種疾病。在中國，它是登革熱與登革出血熱的重要媒介。其唾液組分蛋白具有抗凝血、抗炎和免疫調控的功能［1］。已有的研究結果提示每一種蚊蟲唾液組分中約含有100個蛋白分子參與了上述功能。根據對約10種蚊蟲唾液腺轉錄組學分析，提示Serpin家族成員廣泛分布于蚊蟲唾液組分，然而至今僅有少數蛋白成員的作用得到證實。

絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serine Protease Inhibitor，Serpin）是一類蛋白質超家族，它們不僅廣泛存在于動物、植物以及病毒體內［2－3］，還存在于細菌和古細菌體內［4－5］。研究發現Serpin家族成員參與調控蛋白酶介導的一系列生命進程，包括凝血、纖維蛋白溶解、補體激活、炎性介質反應及組織重建過程。Serpin是一種單蛋白質，由3個β折疊，8～9個α螺旋和一個環狀結構區RCL（reactive center loop）構成。蛋白質分子量一般為40～50kDa，由350～500個氨基酸組成。大多數serpin具有抑制絲氨酸蛋白酶的功能，但也有一些能抑制其他種類的蛋白酶，例如，鱗狀細胞癌抗原-1能夠抑制半胱氨酸蛋白 酶［6］，擬 南 芥 serpin-1能夠抑制 名 為 metacaspase-9的半胱氨酸蛋白酶［7］。另外還有一些serpin缺乏蛋白酶抑制功能，而是執行一些其他功能，例如，激素轉運、充當分子監控類蛋白或儲存蛋白［8－9］。Serpin在功能上的不同與其結構有著密切聯系。

2007年Arca等［10］率先采用分子生物學方法構建了白紋伊蚊唾液腺cDNA文庫，從中識別出3條具有信號肽的絲氨酸蛋白酶抑制劑基因家族成員，但具體功能未驗證，鑒于serpin家族成員功能多樣性，為探討該蛋白在蚊蟲吸血與傳病中的作用，本研究對Aalbserpin1基因進行了克隆和生物信息學分析，并表達獲得重組蛋白，為進一步研究Aalbserpin1蛋白的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 白紋伊蚊 白紋伊蚊廣州株由中國軍事醫學科學院微生物流行病研究所媒介生物學與控制研究室惠贈，本室常規養殖，溫度（25±2）℃，相對濕度（80±5）%，光照14h/d，羽化后喂食糖水。

1.1.2 主要試劑和儀器 TRIzol試劑和DNA酶Ⅰ試劑盒購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒（PrimerScript RT Reagent Kit）、熒光定量PCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqⅡ）、pMD18-T載體、BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶、Primer STARTM HS DNA Polymerase、DNA標志物DL2000購自大連TaKaRa公司，其他試劑均為國產分析純產品。熒光定量PCR儀（7300型）為美國ABI公司產品。

1.1.3 載體和宿主菌 pET28a（＋）載體，E.coliDH5α，E.coliOrigami（DE3）為本室常規保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計和合成 根據白紋伊蚊羅馬株Serpin1基因序列（GenBank登錄號為 AY826096.1），設計引物 Aalbserpin1-F1和Aalbserpin1-R，用于白紋伊蚊廣州株全長基因擴增。Aalbserpin1-F和 Aalbserpin1-R，用于構建原核表達系統的基因擴增。Aalbserpin1-F2和Aalbserpin1-R2用于實時熒光定量PCR反應；rsp5F和rsp5R用于實時熒光定量PCR內參基因擴增。引物由上海英駿（Invitrogen）公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequencing primers

1.2.2 RNA抽提 實驗分3組，解剖5d齡未吸血雌蚊唾液腺（SG組）、中腸（MG組）和脂肪體（FB組）。將3組樣品分別置于500μL TRIzol中，電動勻漿器充分勻漿并振蕩混勻，加100μL氯仿旋渦振蕩15s，室溫放置5min，4℃12 000×g離心15min，取上層水相加入等體積異丙醇，室溫靜置30min，4℃12 000×g離心15min，棄上清。加冰預冷的75%乙醇1mL，充分洗滌沉淀，4℃7 500×g離心5min，棄上清，空氣干燥5min，將沉淀溶于1μL水中，1.2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測獲得總RNA的質量和濃度。取總RNA 3μL，DNaseⅠ1μL（1U/μL），室溫孵育15min，加入1μL 25mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），65℃孵育10min，終止反應，去除DNA后即得總RNA。

1.2.3 逆轉錄反應 將上述3組雌蚊的組織總RNA分別行逆轉錄，反應體系為：總RNA 500ng，5×PrimeScript緩沖液2μL，PrimeScript酶混合物0.5μL，寡核苷酸多聚T引物（OligodT）和隨機6堿基引物（Random 6mers）各0.5 μL，加無RNA酶水（RNase Free dH2O）至總體積為20μL。反應條件：37℃30min，85℃5s。反應完成后將3組cDNA置于－20℃保存備用。

1.2.4 Aalbserpin1全長基因的克隆 以SG組的cDNA為模板。用Aalbserpin1-F1和Aalbserpin1-R引物擴增Aalbserpin1全長基因，PCR產物經膠回收后，克隆入pMD18-T載體，并對PCR鑒定陽性克隆子測序。

1.2.5 生物信息學分析 用DNAStar5.0軟件對測得序列進行分析，并與GenBank上獲取的其它物種序列進行同源性比較，采用ExPASy Proteomics Server（http：//cn.expasy.org/tools）的相關軟件分析蛋白的相對分子質量（Mr）、等電點和信號肽等。

1.2.6 重組質粒pET28a-Aalbserpin-1＿2的構建與表達以pMD18-T-Aalbserpin-1＿2為模板，進行 PCR 擴增、產物純化回收。用BamHⅠ和XhoⅠ酶對目的基因和pET28a進行雙酶切，回收純化后用T4連接酶16℃連接過夜，轉入E.coliDH5α感受態細胞，挑取單菌落進行菌液PCR、酶切和測序鑒定。將測序正確的重組質粒pET28a-Aalbserpin-1＿2轉化至E.coliOrigami（DE3）中，挑選陽性單菌落在SOC液體培養基中以IPTG誘導表達后，離心收集菌體，制備成電泳樣品并行12%SDS-PAGE電泳分析。

1.2.7 重組蛋白的純化 對陽性克隆進行大量誘導表達，離心收集菌體、超聲裂解后離心收集上清并過濾，參照Ni-IDA Agarose說明書進行蛋白純化，收集蛋白洗脫液，SDSPAGE電泳分析目的蛋白。

1.2.8 實時熒光定量PCR 取SG組、MG組和FB組cDNA進行熒光定量PCR擴增，每組6個重復。反應體系：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，Aalbserpin1-F2和 Aalbserpin1-R2（10μmol/L）以及rsp5F和rsp5R各0.8μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，cDNA模板1μL，反應條件：95℃30s；95℃5s，60℃34s，共40個循環。

1.2.9 數據分析 采用絕對定量法，對各個基因所得的CT值進行計算（以rsp5為內對照［11］），對其結果進行分析，采用Grahpad Prism 3.03進行統計學分析并制圖。

2 結 果

2.1 PCR擴增 PCR擴增白紋伊蚊廣州株Aalb-serpin-1基因，如圖1所示，在約1 300bp處獲得一特異性擴增片段，大小同預期的結果相符。

圖1 白紋伊蚊Aalbserpin-1基因PCR擴增產物M：DNA 標志物；1：Aalbserpin-1基因Fig.1 PCR amplification of the Aalbserpin-1gene of Aedes albopictus

2.2 序列分析 測序結果顯示，白紋伊蚊廣州株Aalbserpin-1基因獲得2個轉錄本（Alboserpin1＿1和 Alboserpin1＿2），Alboserpin1＿1的基因序列為1 260bp，編碼419氨基酸；Alboserpin1＿2的基因序列為1 332bp，編碼443氨基酸，后者較前者多了24個氨基酸。將2個轉錄本與白紋伊蚊羅馬株（Gen-Bank登錄號為AY826096.1）進行氨基酸序列比對分析，結果顯示Alboserpin1＿2多出的24個氨基酸為NLLTNRIVSQSSYRRVAIYDFISG，插入在第362位氨基酸處，如圖2所示。故推測這24個氨基酸是Aalbserpin-1基因在mRNA水平的可變剪接子。

圖2 Aalbserpin-1的序列比對與分析Fig.2 Sequences alignments and analysis of Aalbserpin-1

2.3 Aalbserpin-1的生物信息學分析結果 將所獲得的兩個轉錄本Aalbserpin-1進行生物信息學分析。ProtParam軟件分析顯示該Aalbserpin-1＿1蛋白質分子量為47 506Da，等電點5.11，Aalbserpin-1＿2 蛋白質分子量為50 242Da，等電點5.75。用InterProScan分析兩個轉錄本的一級結構，結果均含有Serpin結構域，Aalbserpin-1＿2的可變剪接子正好位于于其功能活性中心環（RCL）起始端。Signal P4.0信號肽分析顯示，兩者均具有1個信號肽序列，位于1～18位氨基酸之間。Aalbserpin-1＿2在NCBI上行BLASTp分析，結果顯示，與白紋伊蚊羅馬株的相似性為90%，與埃及伊蚊Serpin 1氨基酸序列（GenBank登錄號為XM＿001656512.1）相似性為74%，與致倦庫蚊Serpin1氨基酸序列（Gen-Bank登錄號為 XM＿001862101.1）相似性只有32%，推測這個Serpin蛋白是伊蚊所特有的。

2.4 pET28a-Aalbserpin-1＿2原核重組質粒的鑒定用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET28a-Aalbserpin-1＿2表達載體，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，獲得約1 300bp的條帶，見圖3。測序結果表明，pET28a-Aalbserpin-1＿2表達載體構建成功。

2.5 pET28a-Aalbserpin-1＿2載體誘導表達及分離純化 將重組質粒pET28a-Aalbserpin-1＿2轉化到大腸桿菌 Origami（DE3）中誘導表達后，SDS-PAGE電泳結果顯示，在Mr 50 000Da處有明顯表達條帶，見圖4（泳道4，5，6），與目的蛋白預期相對分子質量基本相符，通過親和層析獲得純化蛋白，見圖4（泳道7）。

圖4 重組Aalbserpin-1＿2質粒的表達及純化產物SDSPAGE電泳分析M：蛋白標志物，1：未誘導pET-28a（＋），2：誘導pET-28a（＋），3：pET-28a（＋）-Aalbserpin-1＿2未誘導，4：pET-28a（＋）-Aalbserpin-1＿2誘導，5：pET-28a（＋）-Aalbserpin-1＿2誘導上清，6：pET-28a（＋）-Aalbserpin-1＿2誘導沉淀，7：pET-28a（＋）-Aalbserpin-1＿2純化產物Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant Aalbserpin-1＿2 expression product and purified productM：Protein molecular Marker；1：BL21cell containing pET-28a（＋）without IPTG induction；2：BL21cell containing pET-28a（＋）with IPTG induction；3：BL21cell containing pET-28a（＋）-Aalbserpin-1＿2without IPTG induction；4：BL21cell containing pET-28a（＋）-Aalbserpin-1＿2with IPTG induction；5：supernatants of lysate of BL21cell containing pET-28a（＋）-Aalbserpin-1＿2with IPTG induction；6：sediments of lysate of BL21cell containing pET-28a（＋）-Aalbserpin-1＿2with IPTG induction；7：the purified product of pET-28a（＋）-Aalbserpin-1＿2recombinant.

2.6 不同組織Aalbserpin-1基因表達差異 實時熒光定量PCR檢測Aalbserpin-1＿2基因在唾液腺（SG）、中腸（MG）、脂肪體（FB）中的表達差異。將結果進行統計學分析并繪制成圖，如圖5所示，對有可變剪接的Aalbserpin-1＿2基因的檢測發現，Aalbserpin-1＿2在唾液腺（SG）、中腸（MG，P＞0.05）豐富表達，脂肪體低表達（FB，P＜0.05）。

3 討 論

昆蟲是地球上出現最早、種類最多的動物群體，在長期的進化過程中形成了獨特的先天性免疫防御體系。由于昆蟲體內沒有高等動物所具有的淋巴細胞和免疫球蛋白，因此，分解異物的酶，特別是蛋白酶及調控昆蟲體內蛋白酶作用的蛋白酶抑制劑便引起了人們的高度關注。在昆蟲體內，serpin參與生命過程中許多重要的環節，如Kanost等從煙草天蛾幼蟲血液中純化了四種絲氨酸蛋白酶抑制劑，其中一種對豬胰肽酶和牛胰凝乳蛋白酶有抑制作用，兩種對胰凝乳蛋白酶有特異性的抑制作用，另外一種對胰蛋白酶的活性有特異的抑制作用［12－13］。黑腹果蠅serpin27A、28D，煙草天蛾serpin3、岡比亞按蚊serpin2與黑化反應有關。黑化反應是節肢動物防御系統中的一個重要組成部分，而在這個系統中，絲氨酸蛋白酶介導的級聯反應是PPO被激活是關鍵環節［14］。除了調控PPO的級聯激活外，有研究還發現，果蠅屬的serpin43Ac與Toll介導的先天性免疫反應有關［15］。此外，有研究顯示serpin在媒介與病原相互關系中也扮演重要作用。如按蚊屬的serpin10在中腸上皮細胞累積，與瘧原蟲的傳播有關［16］。斯氏按蚊和岡比亞按蚊的serpin6與清除其體內的病原有著明顯的關系［17］。

圖5 Aalbserpin-1＿2基因不同組織表達差異（n＝6）Fig.5 Aalbserpin-1＿2gene expression in different tissues（n＝6）

本研究以白紋伊蚊羅馬株Aalbserpin-1序列信息設計引物，從白紋伊蚊廣州株唾液腺中成功獲得該序列。測序顯示有兩個轉錄本，同源比對分析Aalbserpin-1＿1與羅馬株 Aalbserpin-1序列相似性為95%，而Aalbserpin-1＿2與兩者相比多出了24個氨基酸（NLLTNRIVSQSSYRRVAIYDFISG），故考慮其為可變剪接子。可變剪接是指從1個mRNA前體中通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點組合）產生不同的mRNA剪接異構體的過程，使機體調節基因表達和產生蛋白質組多樣性的重要機制［18］。為深入研究 Aalbserpin-1＿2基因，成功構建了Aalbserpin-1＿2原核表達載體，經IPTG誘導表達，采用鎳柱純化體系對融合蛋白進行了純化，行SDS-PAGE分析，純化蛋白分子量大小與預測的相符，為Aalbserpin-1＿2蛋白質功能的研究奠定了基礎。

已有的研究顯示唾液腺是蚊蟲傳播病原生物的器官，中腸是蚊蟲中病原增殖的器官，脂肪體是蚊蟲的免疫器官，這3個組織在蚊蟲傳病中發揮了重要的作用，因此選擇這三個組織采用實時熒光定量PCR技術，在對可變剪接子處設計特異性引物，進行了不同組織表達譜的分析。結果顯示，唾液腺的表達量與中腸表達量之間的差異不具有統計學意義，與脂肪體的表達量之間的差異具有統計學意義，說明Aalbserpin-1＿2在唾液腺與中腸中均有表達，這個結果卻與前期研究的不同組織表達譜中顯示的在唾液腺中特異性高表達［19］的結果存在差異，推測Aalbserpin-1＿1可能優先在白紋伊蚊唾液腺內表達，因此可變剪接是否會對蛋白功能產生影響需進一步研究。

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