HPV16L1在整合型重組畢赤酵母中的表達及病毒樣顆粒的純化

田曉娟，馮 娟，張麗芳，李文姝，薛向陽

宮頸癌是全球婦女第二大常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命健康，而且近年來宮頸癌發病呈現年輕化趨勢［1］。我國每年宮頸癌的新發病例大約15萬人，導致約8萬人死亡［2］。大量研究證實，高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌的重要病因［3－4］，其中，50%～60%宮頸癌組織可檢測到HPV16［5］，因此，HPV16是引起宮頸癌最重要的型別［6］。

HPV衣殼蛋白L1真核或原核細胞表達后可自行裝配成病毒樣顆粒 （virus-like particles，VLPs）。這種不含病毒核酸的VLPs已證實能有效的誘導機體產生針對HPV的保護性免疫反應［7］。目前，基于 HPV L1VLPs的Gardasil四價疫苗和Cervarix二價疫苗已經批準上市，接種后可誘導出良好的預防效果。但這兩種HPV疫苗價格均較昂貴，尤其是對發展中的國家，限制其推廣使用。中國大陸目前尚未正式引進HPV疫苗［8］。因此，研制經濟有效的HPV疫苗迫在眉睫。特探索HPV16L1在整合型重組畢赤酵母中的表達及病毒樣顆粒的純化，以為HPV疫苗開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達載體pPIC3.5K，原核原核E.coli.DH5α菌株，真核GS115菌株均由本實驗室保存。pMD18-T載體購自TaKaRa公司，限制性內切酶BamHⅠ、EcoR I、BglII，T4DNA 連接酶、核酸分子質量標準DNA Marker、蛋白預染Marker，2×PCR Master Mix均購自Ferments公司；無內毒素質粒抽提純化試劑盒（Endofree Plasmid Maxi Kit）購自Omega公司；HPV 16L1單克隆抗體購自abcam公司，HRP-羊抗鼠IgG購自聯科生物技術有限公司（KPL公司產品）；增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化，小量質粒DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自上海捷瑞生物技術有限公司；Hi-TrapTM Heparin HP column購自美國GE Healthcare公司；其它試劑為國產或進口分析純試劑。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 重組表達質粒pPIC3.5K/HPV16L1的構建 在不改變氨基酸密碼的前提下，用酵母偏愛的同義密碼子替代來自GenBank的野生型HPV16 L1基因序列（ACCESSION No.AY177679）中的酵母稀有密碼子，將優化好的基因進行全序列合成，合成的目的片段經BamH I和EcoR I雙酶切后連接入經過相同酶切處理的真核表達載體pPIC3.5K上，按常規分子生物學方法獲得重組真核表達質粒pPIC3.5K/HPV16L1。以pPIC3.5K載體的通用引物5′AOX和3′AOX進行PCR鑒定，選鑒定出的陽性克隆送測序，測序結果正確的克隆進行下一步實驗。

1.2.2 HPV16L1重組畢赤酵母菌的篩選 上述測序正確的陽性克隆擴大培養后用Endo-Free Plasmid Maxi Kit提取質粒DNA，BglⅡ酶切線性化后，電轉化GS115感受態細胞。采用組氨酸缺陷的MD平板初步篩選陽性克隆，由于MD平板篩選的假陽性比較高，所以本實驗在平板初步篩選的基礎上，再進行PCR鑒定，以確保篩選的陽性克隆確實含有目的片段。

1.2.3 HPV16L1目的蛋白的誘導表達：將陽性轉化菌接種到YPD培養基中活化后，接種至BMGY培養基中培養約18h。將上述菌液室溫4 000rpm離心10min，菌體沉淀加BMMY培養基重懸后誘導表達。每24h向培養基添加無水甲醇至終濃度為1.0%，誘導后每24h取樣，收集菌體沉淀，分析目的蛋白的表達。

1.2.4 重組蛋白的鑒定 利用SDS-PAGE和Western blotting分析重組畢赤酵母菌HPV16L1蛋白表達。高壓細胞破碎儀破碎菌體，40μL菌體裂解液與10μL 5×protein loading buffer混勻，沸水煮沸3min，冷卻后，12 000r/min離心2min，上清經10%SDS-PAGE膠電泳，行考馬斯亮藍染色同時，將PAGE膠上蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，與 HPV16L1單抗（1∶6 000）反應2h，TBST洗膜后，與HRP標記的羊抗鼠IgG二抗（1∶6 000）反應1h，TBST洗膜后，利用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒（天根生化）顯色。通過在暗室中曝光對PVDF膜上的目標蛋白進行分析。

1.2.5 HPV16L1VLPs的純化與鑒定 收集誘導5d的菌體，高壓細胞破碎儀破碎細胞，獲得蛋白樣品。將蛋白樣品在binding buffer（2.68mmol/L KCl，1.47mmol/L KH2PO4，8.1mmol/L Na2HPO4，0.33mol/L NaCl，pH 7.0＋0.01%Tween 80）中4℃透析3h。將透析好的蛋白樣品上樣到 Hi-TrapTM Heparin HP柱，用含不同濃度NaCl的E-lution buffer洗脫，收集包含L1蛋白的片段［9］，利用Western blotting鑒定純化結果。

1.2.6 VLPs的電鏡觀察 將適量純化好的蛋白樣品滴在銅網上，濾紙吸去多余的樣品，然后滴加醋酸鈾染色液，濾紙吸去多余染料，干燥后在透射電鏡下觀察VLPs的大小形態。

2 結 果

2.1 pPIC3.5K/HPV16L1重組質粒的構建及鑒定 將經酵母密碼子優化的HPV16L1基因克隆入pPIC3.5K 載體，構建的pPIC3.5K/HPV16L1重組質粒（圖1A）。PCR可擴增出與預期大小約1 518bp的目的片段，BamH I和EcoR I雙酶切同樣顯示HPV16L1基因已成功克隆入pPIC3.5K載體中（圖1B）。DNA測序進一步驗證pPIC3.5K/HPV16L1重組質粒成功構建。

圖1 pPIC3.5K/HPV16L1重組質粒圖譜和酶切鑒定結果A：pPIC3.5K/HPV16L1重組質粒圖譜；B：pPIC3.5K/HPV16L1重組質粒PCR及酶切鑒定結果。M1：1kDp DNA ladder marker，泳道1：pPIC3.5K/HPV16L1質粒PCR產物，泳道2：pPIC3.5K/HPV16L1質粒，泳道3：pPIC3.5K/HPV16L1質粒BamH I/EcoR I雙酶切產物，M2：250bp DNA ladder markerFig.1 Map and restriction identification of recombinant pPIC3.5K/HPV16L1plasmidA：Map of recombinant pPIC3.5K/HPV16L1plasmid；B：Identification of recombinant pPIC3.5K/HPV16L1plasmid by PCR method and restriction enzyme digestion.M 1：1kDp DNA ladder；Lane 1：PCR product of pPIC3.5K/HPV16L1plasmid；Lane 2：PPIC3.5K/HPV16L1；Lane 3：pPIC3.5K/HPV16L1plasmid digested with BamH I and EcoR I restriction enzyme；M 2：250bp DNA ladder marker.

2.2 甲醇誘導重組蛋白的表達及鑒定 甲醇誘導重組酵母菌，高壓細胞破碎儀破碎菌體獲得目的蛋白后，利用SDS-PAGE和 Western blotting鑒定HPV16L1蛋白的表達。如圖2顯示，甲醇誘導48h后，Western blotting結果中清晰可見與HPV16L1單抗反應的特異條帶，大小約為57kD，與理論分子量相符。由于表達量較低，SDS-PAGE電泳僅見微弱的目的蛋白條帶。

2.3 HPV16L1VLPs的純化與鑒定 肝素鈉柱純化誘導后重組酵母菌蛋白裂解液中自組裝形成的HPV16L1VLPs。以0.6mol/L到1.2mol/L線性梯度的NaCl洗脫目的蛋白，利用SDS-PAGE和Western blotting鑒定純化效果。結果顯示洗脫HPV16L1VLPs的NaCl范圍是0.6～1.0mol/L，見圖3。

2.4 HPV16L1VLPs的電鏡觀察 以1.0mol/L NaCl洗脫純化的蛋白樣品進行醋酸鈾染色，電鏡觀察VLPs。結果顯示，經負染色后，在電鏡下可以看到與天然病毒形態相似的大約55nm左右的病毒樣顆粒，但是其直徑大小不等（圖4）。

圖2 HPV16L1蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析A：HPV16L1蛋白的SDS-PAGE 分析；B：HPV16 L1單抗鑒定目的蛋白。M：預染的protein marker，泳道1：GS115酵母菌；泳道2：pPIC3.5K/GS115酵母菌；泳道3：pPIC3.5K/HPV16L1/GS115酵母菌誘導前；泳道4：pPIC3.5K/HPV16L1/GS115酵母菌誘導48h.Fig.2 Analysis of HPV16L1expression by SDS-PAGE and Western blottingA：Identification of HPV16L1protein in 12%SDSPAGE；B：Identification of HPV16L1proteinby monoclonal antibody.M：Prestained protein marker；Lane 1：GS115strain；2：pPIC3.5K/GS115strain；3：pPIC3.5K/HPV16L1/GS115strain before induction；4：pPIC3.5K/HPV16L1/GS115strain induced for 48h.

圖3 SDS-PAGE和Western blot分析HPV16L1VLPs的純化A：SDS-PAGE分析純化的 HPV16L1VLPs；B：HPV16L1單抗鑒定純化的VLPs。M：預染的protein marker 1：pPIC3.5K/HPV16L1重組酵母菌蛋白裂解液上柱前樣品；2-6：含0.6mol/L，0.7mol/L，0.8mol/L，1.0mol/L，1.2mol/L不同濃度NaCl洗脫液的洗脫樣品。Fig.3 Analysis of HPV16L1VLPs purification by SDSPAGE and Western blottingM：Prestained protein marker；Lane 1：Lysate of induced GS115strain with recombinant plasmid pPIC3.5K/HPV16L1；Lanes 2-6：Elution samples by Elution Buffer containing 0.6mol/L，0.7mol/L，0.8mol/L，1.0mol/L and 1.2mol/L concentrations of NaCl.

圖4 HPV16L1VLPs電鏡觀察Fig.4 Observation of HPV16L1VLPs by electron microscopy

3 討 論

目前批準上市的HPV預防性疫苗價格昂貴，極大地限制了在宮頸癌高發的發展中國家使用。到目前為止，可成功表達HPV L1蛋白的外源表達系統有原核表達系統［10］、酵母表達系統［11］、桿狀病毒－昆蟲細胞表達系統［12］及轉基因植物等［13］。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統是20世紀80年代初期發展起來的一種新型的外源蛋白表達系統。作為真核生物，畢赤酵母具有高等真核表達系統的許多優點：如蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。不僅如此，操作時與E.coli及釀酒酵母同樣簡單。它比桿狀病毒－昆蟲細胞或哺乳動物組織培養等其它真核表達系統更快捷、簡單、廉價，且表達水平更高。同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優點，且它的外源蛋白表達水平是后者的十倍以至百倍。這些使得畢赤酵母表達系統成為目前最優秀、應用最為廣泛的外源基因表達系統之一。本研究探索HPV16L1在整合型重組畢赤酵母中的表達及病毒樣顆粒的純化。

密碼子的偏愛性使得克隆的外源基因往往難以在異種生物細胞高效表達［14］。為提高重組畢赤酵母HPV16L1表達量，本研究根據畢赤酵母的密碼子偏好性對野生型HPV16L1基因進行了密碼子的優化。由于畢赤酵母菌體內無穩定的附加型載體，而且既往的研究也未見HPV L1的分泌型表達，為此，本研究選擇了胞內表達載體pPIC3.5K，利用整合型載體作為HPV16L1外源基因的表達載體。

結果顯示，這種設計能有效表達HPV16L1目的蛋白。純化HPV VLPs的方法常見的有蔗糖墊超速離心法、氯化銫梯度離心法、尺寸排阻色譜法等，但是這些方法步驟復雜，嚴重的影響了目的蛋白的得率，并大大增加了生產成本［9］。由于HPV感染的受體是細胞表面的粘多糖硫酸乙酰肝素［15－16］，而肝素鈉的結構與硫酸乙酰肝素相似，可與構象完整的VLPs結合，與錯誤折疊的VLPs不反應［15，17－19］。為此，我們選擇用肝素純化HPV16L1 VLPs，電鏡負染不但再次證實構建的重組畢赤酵母中能有效表達HPV16L1目的蛋白，而且也證實采用肝素鈉能有效快速地純化 HPV L1VLPs。Knappe表明HPV16VLPs與肝素間的相互作用是依賴于正電荷分布［20］。因此我們將樣品透析后進行VLPs純化。

總之，本研究利用整合型重組畢赤酵母成功的表達了HPV16L1目的蛋白，而且通過肝素一步法快速獲得了結構完整的HPV16L1VLPs，這些研究將為HPV16預防性疫苗新工藝的改善奠定了基礎。

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