新疆羊狂犬病病毒的鑒定及N基因序列分析

陳繼章，谷文喜，鐘 旗，舒 展，呂春華，葉 鋒，馬曉菁，易新萍

狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的以侵犯中樞神經系統為主的急性人獸共患傳染病，是全球病死率最高的急性傳染病之一，死亡率幾乎高達100%。該病廣泛分布于亞、非、歐、美等各大洲，嚴重威脅人畜的健康［1］。近年來，我國人狂犬病發病和死亡人數呈上升趨勢，自2003年以來，發病例數均超過2 000例。RV基因組為單股不分節段的負鏈RNA，由11 928～11 932個核苷酸組成，含5種結構蛋白基因編碼序列，依次為核蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、基質蛋白（M）、糖蛋白（G）和轉錄酶蛋白（L）［2］。其中狂犬病毒核蛋白（N）基因具有較高的保守性，由1 424個核苷酸組成，編碼450個氨基酸。該基因常被用作RV的診斷、基因分型、地域特征、病毒起源、宿主轉換等時空進化分析［3］。

狂犬病的流行一般出現在野生動物中，通過家養動物波及人類，所以家養動物是野生動物狂犬病和人類狂犬病的聯系環節。我國在動物狂犬病的報道中大多數以犬為主，牛羊狂犬病例報道相對較少［4］。1976年新疆首次報道牛狂犬病［5］。本文對新疆羊疑似狂犬病料應用特異性核蛋白基因（N）的RT-PCR方法進行實驗室診斷，通過分子生物學技術獲得該病料中病毒的全基因序列，基于N基因序列對其進行遺傳進化關系分析，以了解新疆狂犬病病原流行地域特征，為狂犬病防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料 采集新疆阿勒泰地區疑似狂犬病羊（被狼咬后）腦組織貯存于－80℃冰箱保存備用。

1.2 材料和試劑 狂犬病毒株SRV9由新疆畜牧科學院獸醫研究所保存。TRIzol?Reagent購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自美國Promega公司，2×PCR Master-Mix和DNA Marker DL2000均購自北京莊盟生物公司，PCR引物由上海基康生物有限公司合成。無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇試劑均為分析純。

1.3 RNA提取和反轉錄 取疑似羊狂犬病腦組織約0.1g，按照TRIzol試劑說明書提取RNA。按照反轉錄試劑盒說明書操作將提取的RNA反轉錄成cDNA。

1.4 RT-PCR鑒定 參考GenBank公布的狂犬病毒SRV9株N基因序列（AF499686）設計特異性引物擴增RV的N基因［6］，引物序列見表1。以反轉錄的cDNA為模板進行套式PCR擴增。外引物PCR反應條件：94℃3min；94℃30 s；退火56℃30s；72℃40s，25個循環；72℃10min。取外引物PCR擴增產物稀釋1 000倍1.0μL為模板，按照以上PCR反應條件進行內引物擴增。PCR反應體系均為50.0 μL。

表1 鑒定狂犬病病毒RT-PCR引物序列Tab.1 Primers of identification of RV virus by RT-PCR

1.5 序列測定及分析 參考GenBank公布的PV株（M13215.1）全基因組序列，應用OLigo 6.0引物軟件設計16個引物分段擴增羊狂犬病毒全基因組［7］，引物序列（表2）及擴增片段示意圖如圖1所示。目的基因經DNA凝膠回收試劑盒回收后和T-Vector16℃過夜連接，連接產物轉化感受態DH5α大腸桿菌，涂Amp抗性平皿后提取質粒經酶切和PCR鑒定，將鑒定正確的質粒交由北京鼎國生物技術公司測序。應用 DNAstar-Lasergene.v.7.1軟件對分段序列拼接獲得臨床癥狀疑似狂犬病的病毒全基因組序列。

1.6 系統進化樹分析 應用NCBI中BLAST軟件對獲得的羊RV的N基因進行分析，通過同源性比對與選擇Neighbor-Joining（NJ）法構建系統進化樹，與 GenBank中公布的其他狂犬病毒株N基因序列（詳細信息略）進行遺傳進化分析。

圖1 RV全基因組分段擴增示意圖Fig.1 Sketch map for segment genome amplification of rabies virus

2 結 果

2.1 RT-PCR鑒定 以狂犬病毒株SRV9為陽性對照，取疑似狂犬病的羊腦組織按1.3方法進行RNA提取并反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，應用外引物（N127和N829）為引物進行PCR擴增，將此PCR擴增產物1 000倍稀釋作為內引物模板進行PCR擴增，結果可見擴增約371bp大小的條帶，與狂犬病毒株SRV9特異性目的片段大小一致，結果見圖2。

表2 擴增狂犬病毒全基因組序列的引物Tab.2 Primers for amplification of the whole genome of RV

圖2 狂犬病毒N基因片段的PCR擴增Fig.2 N gene fragment amplification of RV

2.2 病毒基因組分段PCR擴增 以反轉錄產物cDNA為模板，應用表2中設計的16對引物分別進行PCR擴增，具體結果見圖3所示。

2.3 序列分析 序列測定結果顯示N基因全長1 427bp。應用 DNAstar-Lasergene.v.7.1軟件對分段測序的基因序列進行拼接，獲得羊RV基因組序列全長11 923bp，基因組構成與GenBank公布的其它RV基因組一致。全基因組主要結構蛋白的編碼順序及大小為：3′-N（1 353bp）－P （894bp）－M（609bp）－G（1 575bp）－L（6 387bp）-5′。在結構蛋白基因之間有長度不等的非轉錄的基因間隔區，間隔區的大小各為N-P為2bp、P-M 為5bp、M-G為5bp、G-L為423bp。

2.4 系統進化樹分析 將獲得的羊狂犬病毒基因序列與新疆相鄰國家公布的狂犬病毒100株的N基因序列使用NCBI中BLAST進行比對分析，結果表明該羊RV與蒙古分離的RV株核苷酸同源性為97%～98%，與中東國家的核苷酸同源性為95%～96%，與俄羅斯、東歐（烏克蘭）核苷酸同源性為97%～99%（詳細信息略）。為進一步了解新疆羊RV分子特征，將該羊RV株與同源性較高的烏克蘭、哈薩克斯坦、俄羅斯、伊朗的RV株進行比對分析，結果表明本研究鑒定的羊RV與俄羅斯C群中RVHN株同屬一個進化分支，核苷酸同源性高達99%。與俄羅斯C群RV全基因結構的相比較，新疆羊RV全基因組編碼蛋白基因N、P、M和G片段的大小都一致，唯編碼蛋白基因L片段大小有差異，即新疆羊RV為6 387bp，俄羅斯C群為6 429bp。

圖3 狂犬病毒基因組分段PCR擴增Fig.3 Amplification of the segment genome of rabies virus by PCR

圖4 本研究鑒定的羊狂犬病病毒和相鄰國家狂犬病毒株N基因遺傳進化關系分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on N gene sequence from identified strain and other RV strains from neighboring countries

3 討 論

目前尚無有效的方法治療狂犬病，及時接種疫苗是預防該病的最有效措施之一。快速的病原鑒定是有效防控狂犬病的前提和基礎。國內外關于狂犬病抗原檢測較為成熟且常用的方法主要有熒光抗體試驗（FAT）［9］、酶聯免疫診斷法（ELISA）［10］、反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）［11－12］，由于 PCR方法具有快速、簡單、特異、安全等特點，因此，PCR方法已廣泛應用于實驗室的狂犬病診斷中。本研究對羊似狂犬病病毒病例進行了狂犬病病毒病原檢測，即從疑似病料中應用PCR法擴增到狂犬病病毒特異性N基因，序列測定表明為狂犬病病毒基因組序列的一部分，結合臨床癥狀將疑似病例確診為羊狂犬病。

狂犬病為自然疫源性疾病，以家養動物對人危害最嚴重。狂犬病毒核蛋白基因（N）具有較高的保守性，該基因常用于病毒的檢測及遺傳進化關系分析［13－14］，有效的遺傳進化關系分析為及時更換制苗毒株，提高疫苗免疫效果提供科學依據。我國報道的動物狂犬病主要以犬為主，動物源性的牛羊狂犬病病例診斷較少，國內關于羊源性RV分子流行病學研究缺乏公開的共享序列信息，對該病毒分子特征了解較少，本文將測定的羊源狂犬病病毒的N基因序列和已公布的不同來源的國際上RV株序列進行了比較分析。

狂犬病的傳染源在不同地區有一定差異，研究者Kuzmin IV等根據地域將前蘇聯狂犬病毒株分為不同的5個組群：如北極、阿拉斯加、加拿大等地的A群，西伯利亞東南和遠東地區的B群，俄羅斯、圖瓦和哈薩克斯坦的C群，俄羅斯西部的D群；波羅的海、東北歐及俄羅斯西北部的E群。將這些分離背景、宿主來源或不同地域的RV分離株、疫苗株進行基因組同源性分析，結果表明，各株病毒全基因組均具有較高同源性，間接證明狂犬病毒具有較高遺傳穩定性，而且病毒株親緣關系的密切程度與病毒分離點密切相關。本研究中鑒定的RV與我國公布的RV株、疫苗株等24株相比較，其核苷酸同源性在87%～93%之間。與國外RV株的核苷酸同源性在95%～99%之間。結果表明新疆羊源RV病原與國內來源的RV親緣關系較遠，與國際上RV株親緣關系較近。

由于RV具有一定的地域性，而發生此起羊狂犬病的主要原因是由于牧區羊疑似被狼咬傷所致，因此，本研究將該羊源RV與新疆鄰國的RV分離株進行遺傳進化分析。新疆阿勒泰地區的北部、西部分別和俄羅斯、哈薩克斯坦接壤，其中阿勒泰牛羊牧區草場與哈薩克斯坦和俄羅斯交界的邊境線近100公里。N基因遺傳進化關系表明，新疆羊源RV與俄羅斯和哈薩克斯坦RV分離株核苷酸同源性較高，與俄羅斯C群中RVHN株的核苷酸同源性高達99%，與其屬于同一進化分支。研究結果表明羊源狂犬病毒與俄羅斯C群RVHN株親緣關系最近，新疆阿勒泰地區這起羊RV病原可能來源于俄羅斯邊境線上攜帶RV病毒的野生動物。本研究分析結果為中國RV分子流行病學研究積累了資料。

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