海藻酸鈣/聚精氨酸微膠囊的載藥和緩釋性能

吳文果 ，劉偉 ，王士斌 ，劉源崗 ，陳愛政

（1華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2生物材料與組織工程研究所，福建 廈門 361021）

微膠囊作為一種新型藥物控釋載體，可降低藥物毒副作用，提高藥物穩(wěn)定性，因而在蛋白質(zhì)和多肽類藥物如胰島素[1-3]、干擾素[4-7]、生長因子[8-10]、疫苗的制劑[11-13]等生化藥物的緩（控）釋領域引起眾多研究者的興趣。

海藻酸鹽是從褐藻中提取的天然多糖，是一種陰離子型聚合物，其分子鏈中含有羧酸根和羥基，可以在生理條件下與鈣離子交聯(lián)而形成蛋格結構的凝膠，同時也可以在生理條件下與聚陽離子電解質(zhì)交聯(lián)而形成聚電解質(zhì)復合物膜，因而海藻酸鈉成為蛋白、多肽類藥物載體的研究熱點[1-10]。聚精氨酸是陽離子型的聚氨基酸，可與帶有陰離子基團的聚電解質(zhì)產(chǎn)生靜電作用，形成聚電解質(zhì)膜，同時它的降解產(chǎn)物對人體具有一定的藥理作用和營養(yǎng)功效，在醫(yī)療和制藥方面得到廣泛應用[14-16]，此外，也有研究報道，聚精氨酸和精氨酸能夠促使藥物穿越生物膜，提高藥物的吸收和利用[17-19]。

本文作者采用乳化-固化法，以聚精氨酸為膜材，制備出粒徑為 1μm 左右的海藻酸鈣/聚精氨酸微膠囊?？疾炀劬彼嵯鄬Ψ肿淤|(zhì)量、海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度對海藻酸鈣-聚精氨酸微膠囊載藥量及對牛血紅蛋白緩釋性能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備

海藻酸鈉（美國 Sigma 公司），聚精氨酸（美國Sigma 公司），牛血紅蛋白（Hb，上?？平苌锛夹g有限公司），Span80 和吐溫80 為化學純試劑，異辛烷等其他試劑均為分析純。

IKA RW20DZM.n 數(shù)顯電動攪拌機（德國）；XW-80A 微型漩渦混合儀（上海）；FDU-2100冷凍干燥儀（日本 HITACHI）；S-3500N 掃描電子顯微鏡；紫外可見分光光度計SP-2102U（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 海藻酸鈣/聚精氨酸微膠囊的制備

通過乳化-固化法[20]，制備不同聚精氨酸相對分子質(zhì)量、不同海藻酸鈉濃度、不同氯化鈣濃度的三組海藻酸鈣/聚精氨酸微膠囊。其中，第一組采用10g/L海藻酸鈉溶液、80g/L氯化鈣溶液、不同相對分子質(zhì)量（13.3kD、35.5kD、125kD）的聚精氨酸制備微膠囊；第二組采用80g/L氯化鈣溶液、相對分子質(zhì)量為35.5kD的聚精氨酸、不同濃度（5g/L，10g/L，15g/L）的海藻酸鈉溶液制備微膠囊；第三組采用 10g/L海藻酸鈉溶液、相對分子質(zhì)量為35.5kD的聚精氨酸、不同濃度（40g/L，80g/L，120g/L）的氯化鈣溶液制備微膠囊。微膠囊的制備過程：①配制海藻酸鈉溶液，經(jīng) 0.22μm微孔濾膜過濾，然后將牛血紅蛋白溶于海藻酸鈉溶液中，使牛血紅蛋白的濃度為 5mg/mL；②將含牛血紅蛋白的海藻酸鈉溶液和Span 80 異辛烷溶液于乳化攪拌機上高速攪拌形成油包水（W/O）型體系，10min后，加入吐溫 80 調(diào)節(jié)親水親油平衡值，繼續(xù)攪拌乳化 5min 后，緩慢滴加氯化鈣溶液攪拌固化10min，加無水乙醇靜置分層，然后離心分離出海藻酸鈣微球；③將微球用5mL無水乙醇和蒸餾水分別洗滌兩次，然后加5mL濃度為1mg/mL的聚精氨酸溶液，在漩渦混合儀上混勻、成膜 20min。將所得微膠囊離心分離，冷凍干燥。所制備出的海藻酸鈣/聚精氨酸微膠囊的粒徑大小約為1μm[20-21]。

1.3 海藻酸鈣/聚精氨酸微膠囊的載藥量

稱取2.5mg不同條件制備的微膠囊，溶于5mL pH值為6.8 PBS緩沖液，于37℃、200r/min下振搖提取24h；然后在冰浴條件下超聲破壞微膠囊結構；把處理后的樣品于4000r/min離心5min，取上清液于405nm處測定吸光度值，用式（1）計算微膠囊的載藥量[22]。

1.4 海藻酸鈣/聚精氨酸微膠囊的緩釋性能

稱取20mg不同條件制備的微膠囊，均勻分散于20mL pH值為6.8PBS，于37℃、150r/min條件下進行溶出實驗。于設定的時間點（0.5h，1h，2h，3h，…）取樣5mL，4000r/min下離心5min，測定上清液吸光度值，然后用5mL新鮮PBS重懸微膠囊，倒回原溶出體系。溶出實驗結束后，取5mL混懸液離心分離出微膠囊，加5mL新鮮PBS，超聲破壞微膠囊結構，將處理后混懸液于 4000r/min下離心5min，測定上清液吸光度值計算未溶出藥量。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值（M）±標準偏差（SD）表示，采用SPSS15.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，p＜0.05被認為具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 海藻酸鈣/聚精氨酸微膠囊的載藥量

2.1.1 聚精氨酸相對分子質(zhì)量對微膠囊載藥量的影響

不同聚精氨酸相對分子質(zhì)量制備微膠囊的載藥量如圖1所示。由圖1可知微膠囊的載藥量隨聚精氨酸的相對分子質(zhì)量的增大先升高后降低，當相對分子質(zhì)量為13.3kD時微膠囊的載藥量為9.5%，當相對分子質(zhì)量為 35.3kD時微膠囊的載藥量升高為13.2%，而當相對分子質(zhì)量繼續(xù)升高至125kD時微膠囊的載藥量僅為5.5%。

這是由于在制備海藻酸鈣微球時，鈣離子與海藻酸鈉分子鏈中的古洛糖醛酸（G段）結合，形成“蛋格”狀三維網(wǎng)格結構，所形成的微球是一種多孔隙的結構，與聚精氨酸發(fā)生靜電絡合時，小相對分子質(zhì)量的聚精氨酸更易于進入網(wǎng)格結構的內(nèi)部與海藻酸根羧基（—R—COO?）結合，這樣使形成的聚電解質(zhì)膜較厚，且成膜速度較快，使得在成膜過程中過程損失的牛血紅蛋白的量較少[23]；隨著相對分子質(zhì)量的增大，中相對分子質(zhì)量的聚精氨酸能與海藻酸鈣分子形成更為緊密的網(wǎng)絡結構，載藥量明顯升高（p＜0.05）。當相對分子質(zhì)量增大至 125kD 時，高相對分子質(zhì)量的聚精氨酸進入海藻酸鈣凝膠微球的難度增大[24]，成膜量降低，微膠囊在制備過程中藥物的損失量增大，載藥量顯著降低（p＜0.05）。

圖1 不同聚精氨酸相對分子質(zhì)量制備的微膠囊的載藥量（p＜0.05）

2.1.2 海藻酸鈉濃度對微膠囊載藥量的影響

由圖2可知微膠囊的載藥量隨海藻酸鈉濃度升高顯著（p＜0.05）降低，在5～15g/L時微膠囊的載藥量降低3.7%。據(jù)報道，載入蛋白質(zhì)的性質(zhì)會影響微膠囊的通透性。例如溶菌酶、胰蛋白酶和卵清白蛋白等小分子蛋白幾乎均能滲透進入微膠囊，但大分子牛血清白蛋白難以擴散進入[25]。隨著海藻酸鈉濃度的升高，微球表面海藻酸鈉 G段的—COO?與鈣離子形成的凝膠網(wǎng)格結構越致密，大分子牛血紅蛋白難以擴散進入微球內(nèi)部，從而導致微膠囊載藥量顯著降低[21]。邢楠等[26]的研究結果同樣表明，當海藻酸鈉濃度為 5g/L時，所制備的海藻酸鈣-殼聚糖微膠囊對牛血清白蛋白具有較高的通透性。而當海藻酸鈉濃度繼續(xù)增大至10g/L和15g/L時，海藻酸鈣凝膠網(wǎng)格結構中的鈣離子完全配位，導致對蛋白質(zhì)的通透性能變差。另外，由載藥量公式（1）可知，當海藻酸鈉相對含量升高時，制備的微膠囊的總質(zhì)量隨之增大，而當藥物的含量不變時，這會造成微膠囊的載藥量降低。

2.1.3 氯化鈣濃度對微膠囊載藥量的影響

不同氯化鈣濃度制備微膠囊的載藥量如圖3所示：氯化鈣濃度為40g/L時制備微膠囊的載藥量為10.0%，載藥量相對較小，氯化鈣濃度為 80g/L、120g/L時所制備微膠囊的載藥量有所升高，分別為13.2%、12.4%，但三組載藥量之間差異不顯著（p＞0.05）。隨著氯化鈣濃度的升高，載藥量先升高后減小。這可能是因為：①隨著氯化鈣濃度升高提供的交聯(lián)劑（Ca2+）的量增大，制備海藻酸鈣載藥微球時，交聯(lián)度增大，使得制備過程損失藥物量降低，載藥量升高；②當氯化鈣濃度升高至一定程度時，體系中的交聯(lián)劑的量相對過剩，繼續(xù)提高氯化鈣濃度時，對所形成的海藻酸鈣凝膠結構無明顯影響，因而在較高濃度范圍內(nèi)改變氯化鈣濃度時微膠囊的載藥量變化不大[27]。劉若男等[28]利用海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊包埋小分子蛋白藥物溶菌酶的研究結果表明，Ca2+濃度過低，不足以形成海藻酸鈣微膠囊；Ca2+濃度過高，凝膠收縮程度加強，載藥量降低，當碳酸鈣與海藻酸鈉的質(zhì)量比為7∶40時，載藥量最高，約為 35.0%，遠高于本文對大分子蛋白藥物牛血紅蛋白的載藥量。這是由于在具有同等通透性的微膠囊中，蛋白藥物相對分子質(zhì)量越大，越難以通過膜孔進入微膠囊內(nèi)部，導致載藥量降低[25]。

圖2 不同海藻酸鈉濃度制備的微膠囊的載藥量（p＜0.05）

2.2 海藻酸鈣/聚精氨酸微膠囊的緩釋性能

2.2.1 聚精氨酸相對分子質(zhì)量對微膠囊緩釋性能的影響

圖3 不同氯化鈣濃度制備的微膠囊的載藥量（各實驗組之間的 p＞0.05）

不同聚精氨酸相對分子質(zhì)量制備的微膠囊的緩釋曲線如圖4所示，3種微膠囊在0.5h的釋放量分別為14.0%、10.7%、13.6%，低于藥典規(guī)定半小時內(nèi)釋放量小于 30%的突釋量，可見制備的微膠囊不存在突釋效應[22]。

圖4 不同聚精氨酸相對分子質(zhì)量制備的微膠囊的釋放曲線

從圖4中還可以看出不同相對分子質(zhì)量制備的微膠囊的緩釋性能有所不同：35.5kD聚精氨酸制備的微膠囊的緩釋性能較好；13.3kD與125kD聚精氨酸制備的微膠囊的性能較為接近，其中高相對分子質(zhì)量聚精氨酸成膜微膠囊的緩釋性能稍好。對于低相對分子質(zhì)量聚精氨酸制備微膠囊，成膜材料的相對分子質(zhì)量比較小，雖然成膜時分子可以深入海藻酸鈣凝膠微球較深部位，形成較厚的聚電解質(zhì)膜，但由于其分子鏈上的氨基（—NH2+）相對較少，所形成的膜比較松散；相反，對于高相對分子質(zhì)量的聚精氨酸成膜制備的微膠囊，其分子鏈上的—NH2+較多，與海藻酸鈣凝膠分子鏈上的—COO?結合位點較多，形成的聚電解質(zhì)膜較為致密，但由于膜材相對分子質(zhì)量較大其不能深入到凝膠微球更深的部位，形成的聚電解質(zhì)膜較?。恢邢鄬Ψ肿淤|(zhì)量聚精氨酸由于其較為適中的相對分子質(zhì)量和氨基（—NH2+）數(shù)量，可以形成較厚而且相對致密的聚電解質(zhì)膜；所以13.3kD和125kD的聚精氨酸為膜材制備的微膠囊的緩釋性能比 35.5kD聚精氨酸制備的微膠囊差一些。

2.2.2 海藻酸鈉濃度對微膠囊緩釋性能的影響

海藻酸鈉對制備海藻酸鈣凝膠的網(wǎng)格結構和性能具有重要的影響，進而影響到微膠囊膜的性質(zhì)，實驗考察了不同海藻酸鈉濃度制備的微膠囊的緩釋性能。從圖5可以看出48h藥物的累積釋放量只有50%左右，釋放初期藥物的釋放速率較大，隨釋放時間的延長微膠囊內(nèi)藥物的量降低，釋放速率逐漸減慢，總體釋放情況與不同聚精氨酸濃度制備的微膠囊相似，但不同海藻酸鈉濃度制備的微膠囊的緩釋性能也有一定差別：5g/L海藻酸鈉制備的微膠囊在釋放初期（前8h）與10g/L海藻酸鈉制備的微膠囊的釋放曲線基本重合，24～48h時間段內(nèi)其釋放性能與 15g/L海藻酸鈉制備微膠囊的釋放性能相近；15g/L海藻酸鈉制備的微膠囊的累積釋放率比10g/L海藻酸鈉制備的微膠囊的累積釋放率稍高。當海藻酸鈉濃度較小時，一方面形成的海藻酸鈣水凝膠的網(wǎng)格結構較為松散，網(wǎng)孔較大，牛血紅蛋白分子在凝膠中的擴散時阻力較小，速度較大；另一方面海藻酸鈣分子鏈段提供可與聚精氨酸分子鏈上的氨基（—NH2+）結合的羧基（—COO?）數(shù)量減小，使得所形成的聚電解質(zhì)膜較為松散，因而較低海藻酸鈉濃度制備微膠囊的釋放速率較大，隨著海藻酸鈉濃度的升高所制備微膠囊的釋放速率減小。15g/L海藻酸鈉制備微膠囊的累積釋放率反而增大，可能是由于所形成的海藻酸鈣水凝膠比較致密，聚精氨酸分子不能有效的深入凝膠網(wǎng)格，所形成的聚電解質(zhì)膜較薄的原因[23]。

圖5 不同海藻酸鈉濃度制備的微膠囊的釋放曲線

2.2.3 氯化鈣濃度對微膠囊緩釋性能的影響

Ca2+是海藻酸鈉形成凝膠的交聯(lián)劑，其濃度對海藻酸鈣的凝膠結構也將產(chǎn)生較大影響，Ca2+濃度較小時形成的凝膠網(wǎng)格尺寸較大，隨著濃度的提高網(wǎng)格尺寸有所減小，另一方面，Ca2+與海藻酸根鏈段上羧基（—COO?）的比例影響海藻酸鈣凝膠中羧基（—COO?）的剩余量，以上兩個方面的因素都會影響聚電解質(zhì)膜的形成和性能[23]。

由圖6可知，采用40g/L和80g/L的氯化鈣制備的微膠囊的釋放曲線基本重合，釋放初期釋放速率較快，后期釋放速率變慢，48h的累積釋放率分別為46.4%和47.5%，采用120g/L的氯化鈣制備微膠囊的釋放稍快，12h時的釋放率為42.2%，48h的累積釋放率為 52.7%。分析原因可能是因為隨氯化鈣濃度的升高，一方面形成凝膠網(wǎng)格較小，聚精氨酸分子進入凝膠深度較淺，形成的囊壁較??；另一方面，隨Ca2+量的升高，海藻酸根鏈段上的羧基大量與 Ca2+離子結合，在成膜時和氨基（—NH2）結合的羧基（—COO?）數(shù)量減少，形成的聚電解質(zhì)膜較為松散。

圖6 不同氯化鈣濃度制備微膠囊釋放曲線

3 結 論

（1）中相對分子質(zhì)量聚精氨酸制備的微膠囊的載藥量較高，35.5kD相對分子質(zhì)量聚精氨酸制備的微膠囊的載藥量為13.2%，13.3kD和125kD相對分子質(zhì)量聚精氨酸制備的微膠囊的載藥量分別為5.5%和9.5%；微膠囊的載藥量隨海藻酸鈉濃度的升高而降低，但在 5～15g/L時微膠囊的載藥量降低3.7%，降低幅度不大；氯化鈣濃度為40g/L時微膠囊的載藥量為 10.0%，當氯化鈣濃度升高時微膠囊的載藥量升高，但較高濃度時微膠囊的載藥量隨氯化鈣濃度的變化改變不大。

（2）藥物在 48h內(nèi)的累計釋放量較少，只有50%左右。中相對分子質(zhì)量聚精氨酸成膜的微膠囊具有更好的緩釋效果；海藻酸鈉濃度對微膠囊緩釋性能的影響不是很明顯，5g/L、10g/L、15g/L 海藻酸鈉制備的微膠囊的累積釋放量分別為 52.2%、47.5%、50.9%；氯化鈣濃度為120g/L 微膠囊在48h內(nèi)的累積釋放量為 52.7%，氯化鈣濃度為 40g/L，80g/L時微膠囊的累積釋放量有所降低，但48h內(nèi)的累積釋放量基本一致。

[1]Wang L Y，Gu Y H，Su Z G，et al. Preparation and improvement of release behavior of chitosan microspheres containing insulin[J]. Int. J.Pharm.，2006，311（1-2）：187-195.

[2]Morishita M，Goto T，Nakamura K，et al. Novel oral insulin delivery systems based on complexation polymer hydrogels：Single and multiple administration studies in type 1 and 2 diabetic rats[J]. J.Control Release，2006，110（3）：587-594.

[3]Kim B S，Oh J M，Hyun H，et al. Insulin-loaded microcapsules for in vivo delivery[J]. Mol. Pharm.，2009，6（2）：353-365.

[4]Streck C J，Dickson P V，Ng C Y C，et al. Antitumor efficacy of AAV-mediated systemic delivery of interferon-beta[J]. Cancer Gene Ther.，2006，13（1）：99-106.

[5]Qiu J，Wei X H，Geng F，et al. Multivesicular liposome formulations for the sustained delivery of interferon alpha-2b[J]. Acta Pharmacol.Sin.，2005，26（11）：1395-1401.

[6]Zhou S B，Deng X M，He S Y，et al. Study on biodegradable microspheres containing recombinant interferon-alpha-2a[J]. J.Pharm. Pharmacol.，2002，54（9）：1287-1292.

[7]Pitt C G. The controlled parenteral delivery of polypeptides and proteins[J]. Int. J. Pharm.，1990，59：173-196.

[8]Holland T A，Tabata Y，Mikos A G. Dual growth factor delivery from degradable oligo（poly（ethylene glycol）fumarate）hydrogel scaffolds for cartilage tissue engineering[J]. J. Control Release，2005，101（1-3）：111-125.

[9]Han K，Lee K D，Gao Zga，et al. Preparation and evaluation of poly（L-lactic acid）microspheres containing rhEGF for chronic gastric ulcer healing[J]. J. Control Release，2001，75（3）：259-269.

[10]Shin S H，Lee J，Lim K S，et al. Sequential delivery of TAT-HSP27 and VEGF using microsphere/hydrogel hybrid systems for therapeutic angiogenesis[J]. J. Control Release，2013，166（1）：38-45.

[11]Cheng Q，Peng T Z，Liu A L. Detection of hepatitis B surface antigen using immunovoltammetry with nano-magnetic microsphere[J]. Acta Chim. Sinica，2004，62（24）：2447-2450.

[12]Zhou S B，Liao X Y，Liang Z L，et al. Preparation and characterization of biodegradable microspheres containing hepatitis B surface antigen[J]. Macromol. Biosci.，2004，4（1）：47-52.

[13]Shi L，Caulfield M J，Chern R T，et al. Pharmaceutical and immunological evaluation of a single-shot hepatitis B vaccine formulated with PLGA microspheres[J]. J. Pharm. Sci.：US，2002，91（4）：1019-1035.

[14]劉兆金，印遇龍，鄧敦，等. 精氨酸生理營養(yǎng)研究[J]. 氨基酸和生物資源，2005，27（4）：54-57.

[15]葛奎，陸樹良，青春. 精氨酸代謝及其對創(chuàng)面愈合的影響[J]. 中國臨床營養(yǎng)雜志，2005，13（1）：48-51.

[16]Wieslaw M K，Terry P K，Kristjan S G. Peptide，peptidomimetic and small-molecule drug discovery targeting HIV-1 host-cell attachment and entry through gp120，gp41，CCR5 and CXCR4?[J]. Chem. Biol. Drug.Des.，2006，67（1）：13-26.

[17]Mitchell D J，Kim D T，Steinman L，et al. Polyarginine enters cells more efficiently than other polycationic homopolymers[J]. J. Pept.Res.，2000，56（5）：318-325.

[18]Shah P P，Desai P R，Channer D，et al. Enhanced skin permeation using polyarginine modified nanostructured lipid carriers[J]. J.Control Release，2012，161（3）：735-745.

[19]Nemoto E，Ueda H，Akimoto M，et al. Ability of poly-L-arginine to enhance drug absorption into aqueous Humor and vitreous body after instillation in rabbits[J]. Biol. Pharm. Bull.，2007，30（9）：1768-1772.

[20]劉偉，王瑩，王士斌，等. 乳化－凝膠化法制備藥用載體海藻酸鈣微球的研究[J]. 生物醫(yī)學工程研究，2007，26（1）：156-158.

[21]吳文果，黃曉楠，王士斌，等. 乳化法制備海藻酸鈣/聚組氨酸微膠囊[J]. 化工進展，2009，28（4）：673-677.

[22]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2005.

[23]Cho N H，Seong S Y，Chun K H，et al. Novel mucosal immunization with polysaccharide–protein conjugates entrapped in alginate microspheres[J]. J. Control Release，1998，53（1-3）：215-224.

[24]陳益清，孫多先，劉靜怡，等. 微囊化海藻酸離子移變凝膠的制備、結構與性能[J]. 高等學校化學學報，2003，24（1）：117-120.

[25]劉映薇，于煒婷，劉袖洞，等. 海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉（ACA）微膠囊的蛋白質(zhì)通透性研究[J]. 中國生物醫(yī)學工程學報，2006，25（3）：370-373.

[26]邢楠，田豐，劉圣軍，等. 海藻酸鈣-殼聚糖微膠囊組成對BSA通透性能影響的研究[J]. 化學學報，2007，65（24）：2952-2958.

[27]王康，何志敏. 海藻酸鈉微膠囊的制備及在藥物控制釋放中的研究進展[J]. 化學工程，2002，30（1）：48-56.

[28]劉若男，李俊華，楊嚴俊. 內(nèi)源乳化法制備溶菌酶微膠囊的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（8）：318-324.