溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導慢性心衰兔心肌細胞外信號調節激酶5表達的影響

陳新宇，蔡虎志，史 微，陳青揚，盧 青，劉越美，唐燕萍

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導慢性心衰兔心肌細胞外信號調節激酶5表達的影響

陳新宇1，蔡虎志2，史 微2，陳青揚2，盧 青1，劉越美1，唐燕萍2

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的 觀察溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導慢性心衰模型兔心肌細胞外信號調節激酶5表達的影響。方法 健康新西蘭兔60只，隨機抽取15只為正常對照組，余45只兔耳緣靜脈注射阿霉素4周后，先從中隨機抽取13只為模型4周組，余下實驗兔按心功能分層，隨機分組，再隨機分為模型8周組及各治療組，各組用對應藥物灌胃，連續4周。分別檢測4、8周末兔心肌細胞外信號調節激酶5（ERK5）的總蛋白及蛋白磷酸化（P-ERK5）水平。結果 阿霉素造模后，模型4、8周組心肌P-ERK5水平均下調，兩者較正常對照組差異有統計學意義（P＜0.05），且模型8周組較模型4周組下調更為明顯（P＜0.05）；各組經藥物干預4周后心肌P-ERK5水平較正常對照組仍明顯下調（P＜0.05），但均高于模型8周組（P＜0.05），其中以陽性對照組和溫陽高劑量組心肌P-ERK5水平升高最為明顯（P＜0.05）；各組心肌ERK5水平相比差異無統計學意義。結論 溫陽振衰顆粒能上調ERK5蛋白磷酸化的水平，從而激活ERK5信號轉導通路，其中以高劑量溫陽振衰顆粒最為明顯，這可能是其調控慢性心衰時心室重構和心肌細胞凋亡的重要機制之一。

慢性心衰；溫陽振衰顆粒；阿霉素；細胞外信號調節激酶5；蛋白磷酸化；心?。煌?/p>

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種嚴重心臟疾病終末階段所表現出來的一種臨床綜合征，是各種心血管疾病發展的終末階段，已成為日益關注的最重要的心血管病癥之一?，F已基本明確CHF的發生、發展的分子學基礎是心肌重構或心室重塑[1]。隨著現代醫學的發展，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)亦越來越受到研究人員的關注。MAPK級聯信號轉導途徑存在于所有真核生物中，是細胞外各種信號刺激引起細胞分化、增殖和凋亡等多種反應的共同匯聚點或中樞。而其在心血管方面的作用也正被廣泛地關注與研究[2-3]。細胞外信號調節激酶 5（mitogen-activated protein kinase5，ERK5）是MAPK家族中的一種非典型通路，有研究顯示[4]，ERK5磷酸化（PERK5）的表達對正常心肌細胞的維護起雙向調節作用，抑制其通路活性對病理狀態下的心肌肥厚亦有抑制作用但同時也促進了心肌細胞的凋亡，因此ERK5的變化在CHF的發生、發展與轉歸的過程中可能具有重要作用。溫陽振衰顆粒是臨床治療CHF的有效中藥復方，也是作者的經驗方，經前期研究顯示其具有改善患者心功能及抑制細胞炎性因子的作用，但其作用機制有待進一步研究。本實驗通過阿霉素復制慢性心衰動物模型，來探討ERK5與慢性心衰的關系及溫陽振衰顆粒治療慢性心衰的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 健康雄性普通級新西蘭兔60只，體質量（1.87±0.12）kg，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，動物許可證批號:SCXK（湘）2009-0012。在自由飲食、光/暗周期為12 h/12 h（光照時間為6:00-18:00）、背景噪聲為（40±10）db、溫度（20±3）℃條件下飼養1周以適應環境。

1.1.2 主要藥物與試劑 鹽酸阿霉素 （深圳萬樂藥業有限公司，批號:201109，注射劑，規格10 mg/瓶）；溫陽振衰顆粒 （湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室，批號:201205，8 g/包）；依那普利片（辰欣藥業股份有限公司，批號:201107，5 mg/片）；ERK5抗體（美國Santa Cruz公司，批號:H-300 sc-5626）；PERK5抗體（美國Santa Cruz公司，批號:Y220 sc-135761)。

1.1.3 主要儀器 Beckman LE-80K超速離心機（美國Beckman公司）；DYCZ-24F電泳儀（北京六一儀器廠）；NovaBlot轉印儀 （美國GE healthcare公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 新西蘭兔60只，隨機抽取15只為正常對照組，將余下45只按文獻報道方法[5]進行兔耳緣靜脈注射阿霉素，4周后從存活的43只實驗兔中隨機抽取13只為模型4周組，檢測其心肌ERK5及P-ERK5水平。余下30只實驗兔按心功能分層后，再隨機分為模型8周組、陽性對照組和溫陽振衰顆粒低、中、高劑量組，每組6只。

1.2.2 CHF模型建立 參照張靜等[5]方法，將注射用鹽酸阿霉素用生理鹽水稀釋成1.0 mg/mL溶液，耳緣靜脈注射，每次1.0 mL/kg，每周2次，連續8周。

1.2.3 給藥方法 溫陽振衰顆粒為湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，規格為8 g/包，臨床推薦成人起始劑量8 g/d，實驗兔中藥給藥低劑量按成人70 kg起始劑量體表面積換算，低、中、高劑量按1∶2∶4倍計算。4周末經超聲心動圖檢測提示各組造模成功后，自實驗第5周起，溫陽振衰顆粒低、中、高劑量組分別按0.4、0.8、1.6 g/（kg·d）配以蒸餾水10 mL進行灌胃，陽性對照組依那普利按5 mg/（kg·d）配以蒸餾水10 mL進行灌胃[6]，模型8周組灌服等量蒸餾水，各組連續灌胃4周。

1.3 樣本采集與檢測

1.3.1 心肌組織總蛋白質提取 將預處死兔麻醉后迅速取左室面心肌組織，置入液氮凍存。將凍結的心肌轉移到預先稱質量的離心管中，稱出心肌的質量。按照約1∶8（質量∶體積）的比例加入組織裂解液混合后，冰浴上機械勻漿，渦旋混勻，靜置1 h，21 000 r/min、4℃離心30 min，取上清即為組織的總蛋白質，Bradford方法測定蛋白質濃度，然后分裝，-70℃保存備用。

1.3.2 ERK5和P-ERK5的指標檢測 采用Western-blot檢測，將50 μg心肌總蛋白加入2×SDS上樣緩沖液 （0.1 mol/L Tris pH 6.8，0.2 mol/L DTT，4% SDS，20%甘油，0.02%溴酚蘭)，100℃變性8 min，上樣，恒定電流，前15 min 16 mA/gel電泳，然后32 mA/gel電泳至底部。電轉印按照膜面積0.8 mA/cm2設定電流，轉膜2 h。然后用含3%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h。將膜取出，置于一雜交袋中，分別加入抗ERK5、p-ERK5抗體，4℃過夜。TBS-Tween 20漂洗10 min×3次，將膜取出，置于另一雜交袋中，加入酶標二抗(1∶2 000)，室溫雜交2 h。TBST漂洗10 min×3次。ECL曝光顯像，掃描(300 dpi)，保存，分析。ERK5值以吸光值1（Actin1）、P-ERK5值以吸光值2（Actin2）分別作為對照。

1.4 統計學分析

所有資料采用SPSS 17.0統計分析軟件包進行處理，計量資料均采用“±s”表示，并進行正態性檢驗，多組均數組間比較采用單因素方差分析，顯著性水準P<0.05。

2 結果

2.1 動物數量變化

造模后的45只新西蘭兔分別于造模3、4周時因反復腹瀉各死亡1只，4周末分組后模型8周組、陽性對照組和溫陽中劑量組實驗兔在實驗結束前各死亡1只，考慮為阿霉素推注速度過快致急性中毒所致，正常對照組均生長良好。

2.2 溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導 CHF兔心肌ERK5表達的影響

實驗結果顯示:各組心肌ERK5水平相比差異無統計學意義（P＞0.05），提示各組心肌ERK5水平在阿霉素的誘導下無明顯變化，溫陽振衰顆粒亦不能對ERK5表達產生明顯影響，見表1、圖1。

2.3 溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導性CHF兔心肌PERK5表達的影響

實驗結果顯示:阿霉素造模后，模型4、8周組心肌P-ERK5水平均下調，兩者較正常對照組差異有統計學意義（P＜0.05），且模型8周組較模型4周組下調更為明顯（P＜0.05）。經陽性對照組及溫陽各組治療4周后心肌P-ERK5水平較正常對照組仍明顯下調（P＜0.05），但均高于模型8周組（P＜0.05），其中以陽性對照組和溫陽高劑量組心肌P-ERK5水平升高最為明顯（P＜0.05），且兩者P-ERK5水平相比無明顯差異（P＞0.05）。提示溫陽振衰顆?？杉せ頒HF模型兔心肌P-ERK5的表達，從而影響ERK5信號轉導通路的活化，見表1、圖1。

表1 溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導性CHF兔心肌ERK5、P-ERK5表達的影響 （s）

表1 溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導性CHF兔心肌ERK5、P-ERK5表達的影響 （s）

注:與正常對照組比較#P＜0.05；與模型4周組比較△P＜0.05；與陽性對照組比較▲P＜0.05。

組別正常對照組模型4周組模型8周組陽性對照組溫陽低劑組溫陽中劑組溫陽高劑組n 15 13 5 5 6 5 6 ERK5/Actin1 0.05±0.01 0.06±0.02 0.05±0.01 0.06±0.01 0.05±0.02 0.05±0.01 0.05±0.02 P-ERK5/Actin2 0.78±0.03 0.64±0.02#0.42±0.02#△0.53±0.03#△0.47±0.03#△▲0.48±0.02#△▲0.54±0.02#△

圖1 各組阿霉素誘導CHF兔心肌ERK5、P-ERK5表達的電泳圖

3 討論

近年的研究表明MAPK信號轉導通路異常是CHF的重要發病機制之一，目前，在哺乳動物細胞中發現了4條比較典型的MAPK信號通路:細胞外信號調節激酶1/2、c-Jun N-末端激酶、P38激酶同工酶和ERK5。ERK5是MAPK家族中的一種非典型通路，主要定位于胞質，接受細胞外傳來的信號并由其上游激酶MEK5激活，然后可轉位于細胞核對轉錄因子心肌細胞增強子 （myocyte enhancer factor，MEF2）磷酸化而調節其轉錄活性。其信號通路與經典的MAPK通路一致，由胞外刺激→MAPKKK→MAPKK(MAPKK是ERK5唯一且特異性的上游激酶)→ERK5激活。最初的研究發現細胞因子如表皮生長因子、神經生長因子等能誘導激活ERK5，而ERK5可促進轉錄因子MEF2家族和cAMP應答元件結合蛋白 (camp responds element binding protein，CREB)的磷酸化，這些轉錄因子與細胞生存密切相關。ERK5還可以入核直接調節其他轉錄因子的表達，如c-Jun參與細胞周期的調控，而c-fos可介導ERK5的抗凋亡作用。研究發現ERK5與血管發育、增殖等功能密切相關[7]，自1995年由Zhou等[8]首次克隆后，已發現其控制著一系列原認為由ERK1/2完成的功能，并明確了在氧化應激、低氧、活性氧簇以及各種絲裂原的激動下，在保持血管完整和細胞生長中起到重要作用。Regan等[9]研究發現，ERK5小鼠缺陷模型表現出多種胚胎外血管和胚胎心血管發育遲緩，表明ERK5在心血管發育中起著極其重要的作用。Hayashi[10]等也發現，敲除成年小鼠ERK5基因后，小鼠在2～4周內死亡。本實驗結果說明經阿霉素造模后，模型4、8周組心肌P-ERK5水平均下調，兩者較正常對照組差異有統計學意義，且模型8周組較模型4周組下調更為明顯。經陽性對照組及溫陽各組治療4周后心肌P-ERK5水平較正常對照組仍明顯下調，但均高于模型8周組，其中以陽性對照組和溫陽高劑量組心肌P-ERK5水平升高最為明顯，且兩者P-ERK5水平相比無明顯差異。但各組心肌ERK5水平相比差異無統計學意義，這提示溫陽振衰顆粒可激活CHF模型兔心肌PERK5的表達，從而影響ERK5信號轉導通路的活化，這其中以高劑量溫陽振衰顆粒最為明顯。

溫陽振衰顆粒以溫陽益氣、利水消腫為其基本功效，藥物主要由附片、干姜、紅參、甘草等組成。其中附片有回陽救逆，助陽補火的作用，其性純陽無陰，剛烈迅捷，走而不守，能通上達下，行表徹里，通行十二經脈，乃治療陽衰陰盛、水濕腫滿等病癥之要藥，亦為中醫治病救命之第一品藥。干姜能溫中散寒，回陽通脈?！侗静萸笳妗吩?“干姜大熱無毒，守而不走，凡胃中虛冷，元陽欲覺，合以附子同投，則能回陽立效”，古醫書有“附子無姜不熱”之句。紅參為人參蒸制后干燥者，性微溫，味甘，大補元氣，補脾益肺。甘草味甘性平，能益氣補中，調和諸藥，此方中還可以減輕附片的毒性作用。諸藥合用，共奏溫陽益氣、利水消腫之功。通過前期研究發現溫陽振衰顆粒對于治療CHF顯示出良好的臨床療效，能顯著改善心功能，且可降低血清腫瘤壞死因子-a、內皮素-1水平，上調白細胞介素-10水平[11]。還可降低血漿血管緊張素Ⅱ、心房利鈉肽水平[12]。在心肌細胞凋亡檢測中，能降低心肌細胞凋亡陽性面密度比值，對心肌細胞起到明顯保護作用[13]。本研究結果則進一步提示，溫陽振衰顆粒可能通過上調CHF模型兔心肌組織ERK5蛋白的磷酸化，從而激活ERK5信號轉導途徑的活化，進而對心肌重塑和心肌細胞凋亡起到調控作用。

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（本文編輯 徐愛良）

Effects of Wenyang Zhenshuai Granule on the expression of extracellular signal-regulated kinase 5 of the myocardial tissue in rabbit model with chronic heart failure induced by adriamycin

CHEN Xinyu1，CAI Huzhi2，SHI Wei2，CHEN Qingyang2，LU Qing1，LIU Yuemei1，TANG Yanping2
(1.First Affiliated Hospital,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410007,China;
2.Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To elucidate the effects of Wenyang Zhenshuai Granule on the expression of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) of the myocardial tissue in rabbit model with chronic heart failure induced by adriamycin.Methods 15 rabbits were randomly extracted from 60 rabbits for the control group,13 rabbits were randomly extracted from other 45 rabbits after modeled by intravenous injection of adriamycin for 4 weeks,which is named model 4 weeks group.The rest rabbits were randomly divided into 5 groups including the model 8weeks group and the 4 medicine treatment groups.Each medicine group was given enalapril (positive control)or Wenyang Zhenshuai Granule high dose,medium dose and low dose by gastric administration for 4 consecutive weeks.The expression levels of ERK5 and P-ERK5 in all groups were detected by western blotting.Results P-ERK5 expression levels in myocardial tissue of model 4 and 8 weeks groups were lower than that in control group(P<0.05),and its down-regulation in model 8 weeks group was marked than that of model 4 weeks group.4 weeks after treatment, P-ERK5 expression levels in all medicine treating groups were lower than that of control group, but significantly higher than that of model 8 weeks group(P<0.05).Among of them,up-regulation of P-ERK5 in the positive control group and Wenyang Zhenshuai Granule high dose group were more obviously(P<0.05).There were no significant differences in ERK5 proteins among these groups.Conclusion Wenyang Zhenshuai Granule can promote the level of p-ERK5 protein, then activate ERK5 signal transduction pathway, and Wenyang Zhenshuai Granule high dose group has more significant effects than other two doses groups,which may be one of the mechanisms of Wenyang Zhenshuai Granule regulating the ventricular remodeling and the apoptosis of myocardial cells in chronic heart failure.

chronic heart failure;Wenyang Zhenshuai Granule;adriamycin;ERK5;protein phosphorylation;myocardial tissue;rabbit

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.004.014.05

2013－11－17

國家自然科學基金資助項目 （81173213/H2708）；湖南省科技廳科技計劃項目 （2011FJ3042）；湖南省中醫藥管理局重點項目（201106）；湖南省研究生科研創新項目（CX2011B341）。

陳新宇，男，教授，醫學博士，博士研究生導師，主要從事中醫藥防治心腦血管疾病的研究。