電針對骶上脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠膀胱最大容量和組織形態(tài)的影響

匡靜之，張 泓*，艾 坤，張雨辰，鮑秋影，李景興

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙 410208）

電針對骶上脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠膀胱最大容量和組織形態(tài)的影響

匡靜之，張 泓*，艾 坤，張雨辰，鮑秋影，李景興

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙 410208）

目的 通過觀察電針對骶上脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后神經(jīng)源性膀胱大鼠的膀胱最大容量、組織形態(tài)學(xué)的影響，了解電針治療骶上SCI后神經(jīng)源性膀胱的部分機制。方法 制作骶上SCI后神經(jīng)源性膀胱大鼠模型，電針大鼠“次髎”、“中極”、“三陰交”三穴，采用尿流動力學(xué)、HE染色觀察電針對骶上SCI后神經(jīng)源性膀胱大鼠的膀胱最大容量、膀胱組織形態(tài)的影響。結(jié)果 膀胱最大容量檢測結(jié)果顯示：造模后第14天即治療前1天模型組、針刺穴位組、針刺對照點組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療7 d后，針刺穴位組、針刺對照點組高于模型組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；針刺穴位組、針刺對照點組治療前后比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），模型組與7 d前比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。說明造模后大鼠膀胱最大容量呈下降趨勢，電針治療可明顯改善膀胱最大容量使其趨于穩(wěn)定。HE染色結(jié)果顯示：電針可減輕膀胱組織形態(tài)病理損害程度，且針刺穴位組效果優(yōu)于針刺對照點組。結(jié)論 電針骶上SCI后神經(jīng)源性膀胱大鼠“次髎”、“中極”、“三陰交”三穴可明顯改善膀胱最大容量的穩(wěn)定性，減輕膀胱組織病理損害程度，從而抑制膀胱逼尿肌亢進，恢復(fù)膀胱功能。

電針；骶上脊髓損傷；神經(jīng)源性膀胱大鼠；膀胱最大容量；組織形態(tài)

骶上脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后引起的神經(jīng)源性膀胱(Neurogenic bladder，NB)臨床上多以膀胱儲尿功能下降、尿急、尿頻為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致急迫性尿失禁，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生命安全。有大量研究認(rèn)為，骶上SCI后引起的逼尿肌反射亢進是由于破壞了能對骶髓排尿中樞產(chǎn)生抑制作用的神經(jīng)中樞或傳導(dǎo)纖維，形成了新的骶髓反射弧[1-4]。已有研究[5]證實電針治療有促進損傷脊髓修復(fù)的作用，本文通過觀察電針對骶上SCI后神經(jīng)源性膀胱大鼠的膀胱最大容量、膀胱組織形態(tài)的影響，以了解電針治療骶上SCI后神經(jīng)源性膀胱的部分機制。現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和分組 40只雌性SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK<湘>2011-0003。常規(guī)飼養(yǎng)20 d后編號，隨機取10只作為空白組，其余30只大鼠進行骶上脊髓損傷的手術(shù)造模，14 d后確定神經(jīng)源性膀胱模型成功后再用隨機數(shù)字表法分為3組:模型組、針刺穴位組、針刺對照點組，每組10只。

1.1.2 主要儀器 SDZ-V型華佗牌電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；3F輸尿管導(dǎo)管（上海上醫(yī)康鴿醫(yī)用器材有限公司）；820型薄片切片機 （美國AO公司）；XS-200型雙目顯微鏡（江南光學(xué)集團）；Bx-70顯微成像系統(tǒng) （日本Olympus公司）；IPP6.0圖像分析系統(tǒng)（美國MEDIA CYBERNETICS）。

1.2 模型制備

除空白組外，其余3組參照Hassan Shaker[6]脊髓橫斷法并加以改良，制作骶上脊髓損傷模型。具體操作方法如下:大鼠禁食不禁水12 h后進行手術(shù)，術(shù)前2 h腹腔注射青霉素鈉20萬U以抗炎。用10%水合氯醛按30 mg/kg進行腹腔注射麻醉，將大鼠以俯臥位固定于鼠板上，以其浮肋連接第13胸椎作為骨性標(biāo)志來定位，脊髓損傷節(jié)段統(tǒng)一定在第10胸椎下，確定部位后備皮、消毒，沿背部正中線以T10-11為中心做長約2～3 cm的縱向切口，向兩側(cè)分離皮膚及皮下組織，暴露T10、T11棘突以及與之相鄰的椎弓。用顯微咬骨器從尾側(cè)向頭側(cè)咬除T10椎板至兩側(cè)椎弓根，直至脊髓暴露。然后用牙科彎鉤將椎間隙中的脊髓勾出，手術(shù)刀尖快速切斷，可反復(fù)幾次以確保脊髓完全橫斷。術(shù)后觀察大鼠的心跳和呼吸無異常后，分層縫合肌肉、皮膚。術(shù)中用消毒紗布壓迫止血，術(shù)后絡(luò)合碘消毒傷口并皮下注射乳酸鈉林格液2 mL以防止術(shù)后電解質(zhì)紊亂。以雙下肢癱瘓作為 SCI造模成功的標(biāo)志。大鼠術(shù)后均置于37℃恒溫電熱毯上單籠飼養(yǎng)，每天腹腔注射20萬U青霉素鈉進行抗感染處理，連續(xù)7 d。脊髓休克期膀胱處于尿潴留狀態(tài)每天手法輔助排尿2～3次，術(shù)后第12～14天大鼠均度過脊髓休克期，膀胱出現(xiàn)無抑制性收縮，膀胱最大容量明顯下降，說明骶上SCI后神經(jīng)源性膀胱模型造模成功，第15天開始治療。

1.3 治療方法

空白組不做任何處理，模型組只捆綁不針刺，針刺穴位組和針刺對照點組選取直徑0.3 mm×25 mm的毫針進行針刺，針刺穴位組選取 “次髎”、“中極”、“三陰交”三穴，針刺對照點組選取上述三穴的對照點，根據(jù)李忠仁主編[7]《實驗針灸學(xué)》及華興邦等[8]制定的《實驗動物穴位圖譜》提供的方法，并模擬人體腧穴骨度分寸法量取。具體定位及操作如下:“次髎”[9]（第2骶后孔處），直刺15 mm；“中極”（神闕穴[10]與恥骨聯(lián)合上緣連線的上 4/5與下 1/5的交點），直刺5 mm；“三陰交”（后肢內(nèi)踝尖直上方1 cm處），直刺5 mm；“次髎對照點”（次髎外側(cè)旁開0.3 cm處取穴），直刺15 mm；“中極對照點”（中極左側(cè)旁開0.3 cm處取穴），直刺5 mm；“三陰交對照點”（三陰交向后旁開0.3 cm處取穴），直刺5 mm。針刺后接用SDZ-V型華佗牌電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），中極與三陰交為一組（三陰交左右兩穴隔日交替進行），左右兩次髎穴為一組。電針刺激參數(shù):疏密波，密波頻率50 Hz，疏波頻率10 Hz，密波工作9 s，疏波工作5 s，強度以肢體輕顫并耐受為度。治療時間20 min，每隔24 h治療1次，共7次。

1.4 觀察指標(biāo)、樣本采集及檢測方法

1.4.1 大鼠一般情況觀察 反應(yīng)、進食、活動、爬行、膀胱充盈度及是否需要手法輔助排尿。

1.4.2 膀胱最大容量觀察 將大鼠仰臥位固定，碘伏消毒大鼠尿道外口及肛門。兩根導(dǎo)管置入前均滅菌處理，然后用無菌生理鹽水充盈并排出導(dǎo)管中的氣體，先將一根F3輸尿管導(dǎo)管用石蠟油潤滑后從大鼠尿道外口緩緩置入尿道和膀胱，深約 4.0～ 5.0 cm，其后將另一根F3輸尿管導(dǎo)管潤滑后從前一根的后方緩緩導(dǎo)入尿道和膀胱，深度同前，最后用膠布將兩根導(dǎo)管固定，分別作為灌注管（紅色）和溢出管（黑色）。用手法輔助排尿的方法將大鼠膀胱中的殘余尿量從導(dǎo)管中完全排出后，用1 mL的注射器抽取無菌生理鹽水緩緩從灌注管（紅色）推入，速度為0.01 mL/s，密切觀察另一根平放于鼠板的溢出管（黑色），直到有液體溢出時停止灌注，記錄推入的生理鹽水容量總和即為膀胱的最大功能容量。

1.4.3 組織形態(tài)觀察 7次治療后，4組大鼠進行1次膀胱最大容量的觀察并記錄，然后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。在全麻狀態(tài)下迅速剖腹，取出膀胱組織用冰生理鹽水沖洗后放入4%的多聚甲醛溶液中固定24～48 h，行HE染色，做顯微觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

造模前，各組大鼠均反應(yīng)靈活、活動自如、有自主排尿能力。實驗期間，空白組大鼠如前，模型組、針刺穴位組、針刺對照點組大鼠造模術(shù)后分為兩個時期:（1）脊髓休克期:3組大鼠后肢沒有參與行走，只在前肢行走時處于拖動狀態(tài)，膀胱脹大明顯，出現(xiàn)尿潴留，每天需手法輔助排尿2次。（2）脊髓休克期過后:大鼠后肢仍不能參與行走，膀胱脹大不明顯，無需手法輔助排尿，下腹部及籠內(nèi)墊料潮濕。且經(jīng)治療后針刺穴位組和針刺對照點組與模型組比較，膀胱較充盈。

術(shù)后并發(fā)癥主要有傷口和肺部及泌尿系感染、血尿、褥瘡、自殘。正式實驗過程中，感染和血尿出現(xiàn)4例，自殘出現(xiàn)2例，褥瘡出現(xiàn)3例，整個實驗結(jié)束時3組大鼠的存活情況:模型組7只，針刺穴位組8只，針刺對照點組7只。

2.2 膀胱最大容量的觀察

膀胱最大容量檢測結(jié)果顯示:造模后第14天即治療前1天模型組、針刺穴位組、針刺對照點組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療7 d后，針刺穴位組、針刺對照點組高于模型組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；針刺穴位組、針刺對照點組治療前后比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），模型組與7 d前比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。上述結(jié)果表明造模后大鼠膀胱最大容量呈下降趨勢，電針治療可明顯緩解其下降趨勢，使膀胱最大容量趨于穩(wěn)定。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠治療前后膀胱最大容量的比較 （mL，±s）

表1 各組大鼠治療前后膀胱最大容量的比較 （mL，±s）

注:與空白組比較▲▲P＜0.01；與模型組比較◆◆P＜0.01;與同組治療前比較★★P＜0.01。

組別空白組模型組針刺穴位組針刺對照點組n 10 7 8 7治療前0.920±0.079 3.185±0.567▲▲2.887±0.473▲▲2.851±0.629▲▲治療后0.930±0.067 1.686±0.363▲▲★★2.750±0.363▲▲◆◆2.729±0.515▲▲◆◆

2.3 膀胱組織形態(tài)的觀察

通過光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠膀胱的組織形態(tài)學(xué)可見:（1）空白組:可見移形上皮細(xì)胞整齊排列，固有膜完整，無炎性及水腫改變。逼尿肌細(xì)胞形態(tài)大小均一，肌纖維有序排列，肌束之間結(jié)構(gòu)緊密，結(jié)締組織充滿間隙（圖1-A）。（2）模型組:逼尿肌纖維的數(shù)量和層次顯著高于空白組，同時肌纖維肥大，上皮的層次和數(shù)量也增多，固有層及黏膜層附近有出血，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，部分肌層及漿膜下層可見散在的表面顆粒狀的肥大細(xì)胞（圖1-B）。（3）針刺穴位組:逼尿肌纖維的數(shù)量和層次輕度增高，上皮層次和數(shù)量輕度增多，固有層及黏膜層附近少量出血，少數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，肌層及漿膜下層可見少數(shù)顆粒狀的肥大細(xì)胞（圖1-C）。（4）針刺對照點組:逼尿肌纖維的數(shù)量和層次輕度增高，上皮層次和數(shù)量輕度增多，固有層及黏膜層附近少量出血，少數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，肌層及漿膜下層可見少數(shù)顆粒狀的肥大細(xì)胞（圖1-D）。

圖1 各組膀胱組織形態(tài)學(xué)的光鏡圖（HE×400）

3 討論

脊髓是控制尿道外括約肌和逼尿肌功能活動的初級排尿中樞，也是連接高級排尿中樞的神經(jīng)纖維與膀胱尿道，并將兩者間的感覺沖動相互傳導(dǎo)的共同通道。骶上SCI后，腦橋排尿中樞與下級排尿中樞之間的聯(lián)系中斷或部分損傷，而骶髓排尿中樞保持了完整并失去了上級排尿中樞的控制，排尿反射從長程的脊上調(diào)節(jié)變成節(jié)段性反射，逼尿肌自發(fā)地產(chǎn)生興奮，出現(xiàn)無抑制性收縮。

本實驗通過對治療前后各組大鼠膀胱最大容量的檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠骶上脊髓損傷并度過脊髓休克期以后，膀胱逼尿肌會出現(xiàn)無抑制性收縮、膀胱最大容量呈逐漸減小趨勢，并隨著損傷后時間的延長，膀胱最大容量會逐漸降低，如模型組7 d后較7 d前比較膀胱最大容量明顯降低（P＜0.01），而經(jīng)電針治療的針刺穴位組和針刺對照點組大鼠膀胱最大容量基本趨于穩(wěn)定，無明顯減小趨勢，治療前后比較無明顯差異（P＞0.05），提示電針可有效地減輕膀胱逼尿肌的無抑制性收縮，增加膀胱的順應(yīng)性，使膀胱功能得到一定程度的恢復(fù)。

本實驗HE染色結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組中逼尿肌纖維的數(shù)量、層次、形態(tài)均發(fā)生病理改變，此外還兼有出血、炎性病變、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞等病理改變。而針刺穴位組和針刺對照點組膀胱組織的病理改變程度較模型組明顯減輕，這可能是電針刺激了膀胱逼尿肌纖維和細(xì)胞，使得膀胱逼尿肌組織在受到非致死性傷害后發(fā)生改變和適應(yīng)的能力恢復(fù)正常，從而減輕了大鼠膀胱逼尿肌的組織形態(tài)學(xué)損害。此外，針刺穴位組略優(yōu)于對照點組，說明針刺次髎、中極、三陰交三穴促進損傷后膀胱組織形態(tài)學(xué)的修復(fù)具有穴位特異性。其中，“次髎”穴為足太陽膀胱經(jīng)腧穴，位于骶部，既是局部取穴，又是治療膀胱病的經(jīng)驗效穴，針刺次髎有調(diào)理膀胱經(jīng)氣，促進膀胱與腎對尿液的氣化固攝；“中極”穴為膀胱的募穴，是膀胱經(jīng)氣匯聚之處，可助膀胱氣化，調(diào)節(jié)膀胱功能，善治膀胱約束無權(quán)之尿失禁；“三陰交”穴是肝脾腎三條陰經(jīng)的交會穴，而肝經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng)均循行經(jīng)過小腹，且脾經(jīng)主運化水濕、肝經(jīng)主疏泄、腎經(jīng)主二便，故刺激能達(dá)到調(diào)理肝、脾、腎之經(jīng)氣，促進腎與膀胱對尿液的氣化固攝[11]，起到調(diào)節(jié)膀胱功能的作用。

電針對骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的療效已得到臨床和實驗的肯定，本實驗結(jié)果從電針次髎、中極、三陰交三穴可改善膀胱最大容量、減輕膀胱組織形態(tài)的病理改變，部分闡述了其對神經(jīng)源性膀胱的可能保護機制，從而達(dá)到調(diào)節(jié)膀胱功能、指導(dǎo)臨床中電針治療神經(jīng)源性膀胱應(yīng)用的作用。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of electroacupuncture on maximum bladder capacit and histomorphology in rats with neurogenic bladder after sacral spinal cord injury

KUANG Jingzhi,ZHANG Hong,AI Kun,ZHANG Yuchen,BAO Qiuying,LI Jingχing
(College of Acupuncture and Massage,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To understand the mechanisms of electroacupuncture on neurogenic bladder by investigating the effects of electroacupuncture on maximum capacit and histomorphology in rats after sacral spinal cord injury(SCI).Methods Rat model with neurogenic bladder was produced by SCI,and model rats were treated by electroacupuncture at “Ciliao”,“Zhongji”,“Sanyinjiao”three points.The urodynamics was used to test the effects of electroacupuncture on the maximum capacity ofthe bladder.HE staining was used to observe the effects of electroacupuncture on the bladder histomorphology.Results 14 days after modeled,there were no differences in bladder capacity among model group,electroacupuncture at acupoint group and electroacupuncture control group.7 days after treatment,bladder capacity in electroacupuncture at acupoint group and electroacupuncture control group were higher than that of model group(P<0.01); there were no differences in electroacupuncture at acupoint group and electroacupun cture control group before and after treatment (P>0.05); there were marked differencesin model group before and after treatment(P<0.01).Bladder capacity was decreased after modeled, and electroacupuncture can improve the maximum bladder capacity and make it stable.Moreover, electroacupuncture alleviated pathological damage of bladder,and the effects of electroacupuncture acupoint group was better than that of electroacupuncture control group.Conclusion The effects of Electroacupuncture at rats “Ciliao”, “Zhongji”, “Sanyinjiao”three acupoints on neurogenic bladder after SCI can obviously improve the stability of maximum bladder capacity,reduce bladder tissue pathological damage,thereby inhibiting bladder detrusor hyperreflexia,recovering bladder function.

Electroacupuncture;sacral spinal cord injury;neurogenic bladder;maximum bladder capacity;histomorphology

R245.97；R651.2；R694.5

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.014.047.04

2013－09－11

湖南省自然科學(xué)基金項目（13JJ3098）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（201109）；湖南省教育廳科研項目（12C0264）。

匡靜之，女，碩士，主要從事針灸治病機制的研究。

*張 泓，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:zh538127@sina.com。