不同時程電針預處理對腦缺血大鼠血腦屏障功能的保護效應

劉建勛,林咸明

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不同時程電針預處理對腦缺血大鼠血腦屏障功能的保護效應

劉建勛1,林咸明2

(1.寧波市第二醫院,寧波 315010;2.浙江中醫藥大學第三臨床醫學院,杭州 310053)

通過觀察不同時程電針預處理對腦缺血大鼠腦含水量及血腦屏障通透性的影響,評價電針預處理對腦缺血大鼠血腦屏障功能的保護效應。將清潔級健康雄性SD大鼠隨機分為5組(=48),模型對照組、電針預處理1 d組、電針預處理3 d組、電針預處理7 d組及電針預處理15 d組,電針預處理各組電針預處理結束后建立大鼠單側大腦中動脈阻塞(MCAO)模型,分別于腦缺血12 h、24 h和48 h,檢測腦含水量、血腦屏障EB透過量。模型對照組腦缺血12 h和48 h時間點大鼠腦含水量及血腦屏障EB透過量均低于腦缺血24 h時間點(＜0.05);電針預處理15 d組在腦缺血各時間點對腦含水量及EB透過量的減少作用顯著(＜0.05,＜0.01＜0.001)。腦缺血12 h、24 h、48 h3個時間點中以腦缺血24 h時間點血腦屏障損傷程度顯著;電針預處理可通過明顯降低腦缺血大鼠腦水腫及血腦屏障通透性發揮其對腦缺血大鼠血腦屏障功能的保護效應。

電針;預處理;腦缺血;血腦屏障;大鼠

由于缺血性腦血管病的高發病率、高致死率、高致殘率,目前尚缺乏高效的治療手段,近年來,針對腦缺血損傷的腦保護研究層出不窮,其中預處理是非常重要的預防措施之一。由預處理產生的腦保護現象稱為“腦缺血耐受”。預處理的方式多種多樣,短暫腦缺血、遠程缺血、低氧、高壓氧、麻醉劑及促炎性細胞因子等,但是其中很多預處理方式在臨床中有著不可操作性。國內已有研究者發現電針預處理可誘導腦缺血耐受[1-4]。利用電針可誘導腦缺血耐受這一效應及該療法的優勢,開展對缺血性腦血管高危人群的預防性治療具有積極意義。血腦屏障(blood brain barrier, BBB)是腦組織與血管之間的維持各種物質穩定的重要結構,腦缺血損傷后血腦屏障破壞以及并發的腦水腫是缺血性腦血管病的主要病理損害。血腦屏障結構與功能的完整性與腦水腫的形成密切相關,要研究電針預處理對缺血性腦血管病的腦保護作用,解決血腦屏障受損的問題是防治缺血性腦血管疾病所致損傷的關鍵[5]。不同時程電針預處理對血腦屏障功能保護作用的研究未見報道,本研究的目的之一,就是尋求電針預處理對腦缺血大鼠血腦屏障功能保護作用的最佳電針預處理時程。

本實驗對SD大鼠進行不同時程電針預處理(預處理1 d、3 d、7 d、15 d),再參照Longa線栓法[6]建立大鼠單側MCAO模型,動態觀察不同時程電針預處理對血腦屏障功能(腦含水量、EB透過量)的影響,以揭示電針預處理對實驗性腦缺血大鼠血腦屏障通透性的保護作用,并比較不同時程的電針預處理保護效應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級健康雄性SD大鼠240只,體重(250±20)g,購自中科院上海實驗動物中心,飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心。采用隨機數字表分配法將大鼠分為5組(=48),即模型對照組、電針預處理1 d組、電針預處理3 d組、電針預處理7 d組以及電針預處理15 d組。各電針預處理組進行相應時程的電針預處理后,各組大鼠建立單側MCAO模型,再將各組分成單側腦缺血12 h、24 h和48 h3個亞組,其中8只進行腦含水量測定,另8只檢測伊文思藍透過量。

1.2 電針預處理方法

取百會、水溝(取穴點位置參照華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》),采用華佗牌0.20 mm×25 mm針灸針刺入穴位,連接HANS-100電針儀,頻率2/15 Hz,電流1 mA,每次30 min,每日1次。

1.3 單側MCAO模型建立方法

參照Longa線栓法[6]建立SD大鼠單側MCAO模型。術前24 h禁食、不禁水。用10%水合氯醛(0.35mL/100g體重)對大鼠進行腹腔注射,完全麻醉后,固定,備皮,碘伏消毒,生理鹽水脫碘,垂直于目外眥與耳屏之間連線切口約1 cm,鈍性分離肌肉,暴露顳骨,置于激光多普勒血流監測儀下監測腦部即時基礎血流,再將大鼠取仰臥位固定,于頸前皮膚正中切口1.5 cm,暴露右側頸三角,分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA),在頸總動脈下端打一死結。游離頸外動脈主干,在其與頸內動脈交接的根部用1號線打一死結。用縫合線阻斷左側頸總動脈并用止血鉗暫時阻斷頸內動脈血流,在右側頸總動脈位于其與頸外動脈交接位置下端約2 mm處剪一約相當于頸總動脈直徑1/4大小的切口,松開夾緊頸內動脈的止血鉗,將制備好的栓線插入頸內動脈(線栓為4號魚線,長約25 mm,預先蘸有肝素鈉),進入頸內動脈顱內段,當遇有輕微阻力時停止,同時用激光多普勒血流儀監測缺血程度,以腦血流下降至基礎值的(45±10)%為MCAO大鼠模型缺血程度,栓子插入19～22 mm,栓線經頸內動脈與頸外動脈分叉輕插入顱內至大腦前動脈(ACA),該深度恰好堵塞MCA開口,栓線外端留出約5 mm,90 min后進行再灌注,將線栓抽至頸內動脈起始部,即恢復MCA血供,用縫合線扎緊線栓后消毒、縫合皮膚,同時予青霉素鈉肌注。同步喂養,取材。

1.4 腦含水量測定

腦含水量的測定參照Meng等[7]的方法。取造模后12 h、24 h、48 h共3個時間點,麻醉大鼠,斷頭取腦,棄去小腦及雙側嗅球,稱取右側濕重(Wet weight,WW),恒溫烤箱110 ℃/24 h烘干后稱取干重(Dry Weight,DW)。干-濕比重法測定腦組織含水量,計算各組右側的腦組織含水量,計算公式為(WW－DW)/WW×100%。

1.5 腦缺血大鼠血腦屏障EB透過量的測定

血腦屏障通透性是按照Uyama O等的方法[8],通過滲出血管外的伊文思藍(EB)(Fluka進口分裝)來評價的。在造模后12 h、24 h和48 h用10%水合氯醛麻醉大鼠(35 mg/100 g體重),經股靜脈注入2% EB生理鹽水溶液(4 mL/kg),大鼠眼球結膜、四肢迅速藍染,表明EB注入成功。1 h后開胸通過左心室灌注生理鹽水),直到右心房流出的液體無色為止,斷頭取腦,取損傷側背外側新皮層,樣品稱重并置入50%三氯乙酸溶液中。勻漿和離心(10000 rpm,20 min),取上清液按1:3的比例用乙醇稀釋。熒光值通過多功能酶標分析儀測得(激發波長620 nm,發射波長680 nm)。根據EB溶液(0～50 ng/mL)的外在標準繪出的EB與熒光值之間的線形標準曲線,可以得出腦組織中EB的含量,并用每克組織含量來表示(ng/g)。

1.6 統計學方法

所有數據采用SPSS16.0統計軟件進行分析,計量資料用均數±標準差表示,多組間計量資料比較采用單因素方差分析();組間兩兩比較,方差齊性時用檢驗,方差不齊時用檢驗。以＜0.05作為差異有統計學意義的標準。

2 結果

2.1 不同時程電針預處理對大鼠腦缺血不同時間點腦含水量的影響

從表1中可以看出,不同時程電針預處理大鼠在腦缺血12 h時間點,各電針預處理組腦含水量明顯低于模型對照組(＜0.05),其中電針預處理15 d組與模型對照組比較,腦含水量降低最為明顯(＜0.001)。電針預處理1 d組、電針預處理3 d組和電針預處理7 d組之間無明顯差異(＞0.05),電針預處理15 d組大鼠腦含水量明顯低于電針預處理1 d、電針預處理3 d組(＜0.01),與電針預處理7 d組相比,電針預處理15 d組大鼠腦含水量亦有明顯降低(＜0.05);在腦缺血24 h時間點,模型對照組、電針預處理1 d組、電針預處理3 d組和電針預處理7 d組大鼠腦含水量之間無明顯差異(＞0.05),電針預處理15 d組與模型對照組比較,大鼠腦含水量顯著下降(＜0.001),與電針預處理1 d組和電針預處理3 d組比較,大鼠腦含水量明顯下降(＜0.01),與電針預處理7 d組比較亦有明顯下降(＜0.05);在腦缺血48 h時間點,各電針預處理組與模型對照組相比差異有統計學意義,其中電針預處理1 d組和電針預處理7 d組大鼠腦含水量明顯低于模型對照組(＜0.01),電針預處理3 d組大鼠腦含水量明顯低于模型對照組(＜0.05),電針預處理15 d組與模型對照組比較,大鼠腦含水量顯著下降(＜0.001)。電針預處理1 d組、電針預處理3 d組和電針預處理7 d組大鼠腦含水量之間無明顯差異(＞0.05),電針預處理15 d組大鼠腦含水量明顯低于電針預處理1 d組與電針預處理7 d組(＜0.01),且明顯低于電針預處理3 d組(＜0.001)。

表1 不同時程電針預處理對腦缺血大鼠腦含水量的影響 (±s,100%)

注:與模型對照組比較1)＜0.05,2)＜0.01,3)＜0.001;與電針預處理1 d組比較4)＜0.01;與電針預處理3 d組比較5)＜0.01,6)＜0.001;與電針預處理7 d組比較7)＜0.05,8)＜0.01

2.2 不同時程電針預處理對腦缺血大鼠血腦屏障EB透過量的影響

如表2所示,在腦缺血12 h時間點,各電針預處理組EB透過量明顯低于模型對照組,電針預處理1 d組和電針預處理3 d組與模型對照組比較差異明顯(＜0.01),電針預處理7 d組和電針預處理15 d組與模型對照組比較差異顯著(＜0.001)。電針預處理15 d組大鼠EB透過量明顯低于電針預處理1 d組與電針預處理3 d組,電針預處理1 d組、電針預處理3 d組、電針預處理7 d組之間EB透過量差異不明顯(＞0.05),電針預處理15 d組與電針預處理7 d組相比也無統計學意義(＞0.05);在腦缺血24 h時間點,各電針預處理組大鼠EB透過量明顯低于模型對照組,電針預處理1 d組與模型對照組相比差異明顯(＜0.01),電針預處理3 d組、電針預處理7 d組和電針預處理15 d組與模型對照組相比差異顯著(＜0.001)。電針預處理1 d組、電針預處理3 d組和電針預處理7 d組之間EB透過量無統計學差異(＞0.05)。電針預處理15 d組大鼠EB透過量明顯低于電針預處理1 d組,相比差異顯著(＜0.01),也明顯低于電針預處理3 d組、電針預處理7 d組(＜0.05);在腦缺血48 h時間點,各電針預處理組EB透過量明顯低于模型對照組,電針預處理1 d組和電針預處理3 d組與模型對照組比較差異明顯(＜0.05),電針預處理7 d組與模型對照組比較差異顯著(＜0.01),電針預處理15 d組與模型對照組相比差異顯著(＜0.001)。電針預處理1 d組、電針預處理3 d組和電針預處理7 d組之間相比差異不明顯(＞0.05),電針預處理15 d組與電針預處理7 d組相比差異不明顯(＞0.05)。電針預處理15 d組大鼠EB透過量明顯低于電針預處理1 d組、電針預處理3 d組(＜0.05)。

表2 不同時程預處理對大鼠腦缺血不同時間點血腦屏障EB透過量的影響 (±s,ng/g)

注:與模型對照組比較1)＜0.05,2)＜0.01,3)＜0.001;與電針預處理1 d組比較4)＜0.01;與電針預處理3 d組比較5)＜0.05,6)＜0.01;與電針預處理7 d組比較7)＜0.05

3 討論

血腦屏障是存在于腦組織和血液之間,它通過控制血液循環中的某些物質向中樞神經組織轉運,從而保證中樞神經系統內環境的穩定,其通透能力與中樞神經的變性、損傷和炎癥等密切相關[9-10]。在生理狀態下,血腦屏障相對不通透,主要起屏障功能,嚴格控制水溶性物質如小分子的電解質進入腦組織,只允許氣體分子和脂溶性的物質通過血腦屏障彌散入腦組織。同時,為了維持腦部的營養供給,血腦屏障的轉運系統也使極性物質進出腦組織[11]。血腦屏障的通透性變化受腦細胞相關因素影響。許多調節因子可通過對內皮細胞的轉運系統和酶系統進行影響,改變血腦屏障的通透性[12]。血腦屏障的功能遵循Starlin原理,即任何在單純靜水壓下進入腦組織的水分,都將由被阻留在血管內的電解質和血漿蛋白形成的滲透壓所建立起的一種反向力量將其重新“抽”回血液,從而有效地控制水分子及其溶質進入腦組織[13]。在病理情況下,由于血腦屏障受到破壞,這種調控作用消失,血液的成分,包括電解質和血漿蛋白因血液壓力而經開放的血腦屏障釋入腦組織,即血腦屏障通透性增加。

缺血、缺氧是誘發腦水腫的主要原因,而血腦屏障通透性增加又是腦水腫加重的主要因素。缺血量的多少以及缺血時間的長短與腦損傷的程度有著極大的關系。本實驗結果顯示,腦缺血后腦損傷呈拋物線狀發展趨勢,即在實驗所選取的3個時間點中以腦缺血后24 h時間點損傷最為嚴重,在12 h和48 h時間點損傷呈發展到緩解的狀態。可能與缺血后血腦屏障的自我修復有關。電針預處理可降低腦含水量及減少血腦屏障EB透過量,以電針預處理15 d組效果最為顯著,短時程的電針預處理對降低腦水腫及減少EB透過量有反復性和不穩定性且與腦損傷程度呈負相關,長時程的電針預處理效果明顯優于短時程電針預處理。總而言之,不同時程的電針預處理對血腦屏障功能的保護效應存在差異,以電針預處理15 d的保護效應最為明顯。

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Protecting Effects of Different Time-course Electroacupuncture Pretreatments on Blood-brain Barrier Function in Cerebral Ischemia Rats

1,2.

1.315010,; 2.310053,

To investigate the impactsof different time-course electroacupuncture pretreatments on brain water content and blood-brain barrier permeability and assess their protecting effects on blood-brain barrier function in cerebral ischemia rats.Clean-grade healthy male SD rats were randomly allocated to five groups (=48): model control group, and one-day, three-day, seven-day and fifteen-day electroacupuncture pretreatment groups. A rat model of unilateral middle cerebral artery occlusion (MCAO) was made after electroacupuncture pretreatment was finished in various electroacupuncture groups. The water content of the brain and the amount of EB through blood brain barrier were measured at 12, 24 and 48 hrs after cerebral ischemia.Both brain water content and EB permeation amount were lower at 12 and 48 hrs than at 24 hrs after cerebral ischemia (＜0.05). There was a significant reducing effect on brain water content and EB permeation amount in the fifteen-day electroacupuncture pretreatment group at various time points after cerebral ischemia (＜0.05,＜0.01,＜0.001).The blood-brain barrier is impaired most severely at 24 hrs of the three time points 12, 24 and 48 hrs after cerebral ischemia. Electroacupuncture pretreatment can produce a protecting effect on blood-brain barrier function in cerebral ischemia rats by markedly reducing cerebral edema and blood-brain barrier permeability.

Electroacupuncture; Pretreatment; Cerebral ischemia; Blood-brain barrier; Rats

1005-0957(2014)12-1169-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.12.1169

2014-03-20

浙江省自然科學基金項目(Y2111260)

劉建勛(1983 - ),男,醫師,碩士

林咸明(1966 - ),男,教授,研究方向為針灸治療腦源性疾病的基礎與臨床研究,Email:Linxianming66@126.com