EMS誘變技術在植物育種中的研究進展＊

劉 翔

(上海辰山植物園，中國科學院上海辰山植物科學研究中心，上海 201602)

0 引言

變異是自然界物種進化和選擇過程中一個重要的生理現象，是物種進化的原動力，也是保證生物多樣性的前提。人們利用一系列物理誘變和化學誘變等方式來追求對物種變異的追求，正是誘變育種的基礎所在。通過EMS突變可以改變基因的序列，進而改變基因的功能，從而避免由于轉基因所帶來的潛在的安全性問題。因此EMS誘變技術是植物的現代分子生物學研究種質資源創新的一種行之有效的方法［1］。

1 EMS誘變的原理和特點

常用的植物化學誘變劑主要有烷化劑、堿基類似物、疊氮化物、抗生素、羥胺和吖啶等嵌入染料。烷化劑的誘變原理就是烷化劑能使活性烷基轉移到其它電子云密度較高的分子上，從而多方面改變氫鍵的能力。EMS是一種常見的烷化劑之一，是目前對生物影響最小、效率最高的誘變劑之一，該試劑已經成功應用于各種植物的誘變育種中。EMS的誘變原理如下:EMS分子具有多個能被轉移的活性烷基(－CH1)，當這些烷基轉移到一個電子云密度較高的分子上，可置換堿基中的H原子，該過程即發生了烷化作用。DNA分子上的鳥嘌呤(G)的N7位置是主要烷基化位點之一，該位置被烷基化之后，發生兩種遺傳效應:一是發生嘌呤和嘧啶的轉化突變，即G∶C突變為A∶T，這種類型是最主要的類型。二是發生置換型突變，即烷基化鳥嘌呤由于DNA分子上的糖苷鍵斷裂造成該位置缺失，在隨后的DNA分子復制過程中，該位置被其他的4中堿基替代。另外由于糖苷鍵的磷酸化反應，會造成核苷鏈的斷裂，從而造成染色體的缺失［2］。

EMS作為誘變劑，具有如下的物理和化學特征:EMS分子式 CH3SO2OC2H5，無色液體，分子量為124，水中溶解度為8%。pH 7條件下在水中半衰期20℃時是93 h，30℃時26 h。EMS能使DNA分子上的嘌呤、嘧啶分子發生烷基化來影響mRNA的轉錄，隨后使蛋白的合成過程發生紊亂，進而改變植物的性狀。物理誘變譬如超聲波、γ射線、中子等對物種的損傷較大，容易引起堿基的轉換、顛換、移碼、染色體缺失、易位、倒位等，從而引起生物的突變和死亡。相對于其它化學試劑誘變或者物理誘變，EMS誘變具有如下特點:1)較高的突變頻率和較少的染色體畸變。主要是EMS誘變使DNA分子上產生較多的點突變，對染色體損傷輕而不致引起染色體斷裂產生畸變，可以針對農作物的某一特殊性質進行改良。2)對處理材料損傷輕。EMS誘變相對于其它物理誘變的生物損傷小，不容易引起生活力和可育性下降，尤其是無性繁殖的植物由于不經歷減數分裂過程繁殖后代，相對于可產生種子的植物，這種突變更容易向后代遺傳。3)成本低廉，操作簡便。使用的EMS誘變劑處理材料不需要特殊的設備，成本較低，一次可以誘變大量的材料，誘變效果較好。4)EMS誘變劑對人體更具有危險性。EMS具有強烈的致癌性和揮發性，常用5%硫代硫酸鈉作為解毒劑，因此在操作過程中要注意安全防護，嚴格遵守試驗規則。

2 EMS誘變的方法和技術路線

EMS誘變育種中，誘變材料不同，使誘變效率和篩選難度也有差異。一方面要保證誘變劑的有效滲入，二是要使植物能夠順利生長和發育。對于有大量種子的植物而言，種子是理想的處理材料。對于不易獲得種子的材料，也可以選擇植物的器官和組織進行誘變處理。例如幼穗、花粉、芽、莖、愈傷組織等。處理方法也根據處理材料的不同有所差別，最常用的處理方法有:1)浸泡法，就是把種子、芽等組織浸泡在適當濃度的誘變劑溶液中。以EMS浸泡法構建突變體庫最成功的例子就是擬南芥突變體庫的構建，通過EMS誘變擬南芥種子可以構建覆蓋全基因的突變子［3］。2)滴液法:在植物莖上劃一道較淺的切口，然后將浸透誘變劑溶液的棉球經過切口浸入，此法可用于完整的植株或發育中完整的花序。例如張敏等利用EMS誘變南高叢越橘篩選出了抗旱突變體［1］。3)共培養法:在培養基中用較低濃度的誘變劑處理根或者花藥共培養。例如劉治先等通過EMS處理玉米花藥，從而篩選出高油酸玉米的種質材料［4］。在EMS誘變處理材料的過程中，必須保證有足夠的溶液進入細胞，因此被處理的材料必須完全被溶液浸透，如果能夠附以攪拌，對增加處理效果。由于EMS容易揮發，因此處理溫度最好在20℃左右，并且在密閉狀態下效果較好，這點已經在擬南芥種子EMS誘變中得到證實［5］。

EMS誘變是個復雜的物理和化學過程，尤其是在構建植物突變體庫中，為了獲得較好的誘變效應，必須正確地掌握EMS誘變劑的最佳劑量［5，6］。合適的劑量取決于處理材料本身的特點，同時還和處理濃度、處理時間以及處理時的溫度等有關。不同的物種對EMS的敏感程度不同，因此對EMS的濃度、處理溫度和處理時間的反應效應也不同，必須通過預備試驗來確定最佳的處理劑量。例如王長里等利用5種濃度、6個時間梯度共計30個組合處理小麥品種河農822，統計幼苗致死率和突變頻率，結果標明幼苗致死率和突變頻率在不同處理間，處理時間以及處理濃度間的互作上均產生了明顯影響［6］。隨著EMS濃度的升高，致死效應會逐漸升高，一般而言，EMS誘變劑要求降低10%－30%的苗高為適宜劑量，這一點已經在小麥、擬南芥等植物突變體庫的構建過程中得以證實［5，7］。

對于EMS誘變后代的處理，研究目的不同，后期的技術路線也有差異。根據本實驗室構建二穗短柄草突變體庫的研究目的，建立如下的研究路線(圖1)。該技術要求植物材料經過EMS誘變后，通過第二代M2要篩選出具有表型的突變子，然后通過構建F2作圖群體，利用圖位克隆技術將突變基因進行克隆，進而研究基因的功能。

圖1 通過EMS誘變構建二穗短柄草突變體庫Fig.1 The construction for mutant library of brachypodium distachyon by EMS mutagenesis

3 EMS誘變在植物育種中的應用實例

EMS誘變技術已作為一種有效的手段廣泛應用于植物品質改良與品種選育上，并且創制出了大批具有高產、優質、早熟、矮稈、抗病等農藝性狀的新材料和新品種。在農作物育種中，EMS應用最早、最成功的例子是在玉米中，自Neuffer等將EMS溶于石蠟油中處理玉米花粉獲得成功后［8］，隨后該技術被廣泛應用于篩選出高油酸、高賴氨酸突變體和白玉米、甜玉米、糯玉米等特用玉米類型［9-12］。EMS誘變也應用于大豆中育種中［13，14］，韓鎖義等利用 EMS對“南農86-4”大豆種子進行誘變，構建了大豆品種的突變體庫，并在M3代獲得了蛋白質和油含量變化明顯的材料［14］。EMS在高粱育種中也有較好的效果，Xin等從1600個單株的高粱EMS誘變群體中篩選出768個突變體，并利用TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)技術在該突變體庫中篩選出了編碼咖啡酸甲基轉移酶(Caffeic acidomethyltransferase)基因的兩個突變體［15］。EMS誘變在麥類作物育種中的進展也很迅速，例如Slade等利用EMS誘變分別創建了普通小麥和硬粒小麥的突變體庫，同時以小麥顆粒淀粉合成酶I(Granule-bound starch synthase I，GBSSI)基因片段為引物，篩選出多個突變體［16］。徐艷花等利用EMS溶液處理豫農201種子，對獲得的M2代植株進行農藝性狀及其他生物學性狀的表型篩選，結果共獲得722份葉、莖、穗和其他性狀發生變異的突變體，其中139份葉片性狀突變、220份莖稈性狀突變、38份穗部和籽粒性狀突變、325份其他性狀突變，突變頻率分別為2.20%、3.49%、0.60%、5.15%，研究初步構建的豫農 201 EMS突變群體可應用于小麥功能基因組研究和小麥遺傳改良［7］。另外EMS技術還廣泛應用于谷子等其它農作物的品質改良方面的研究［17］。現代分子生物學的飛速發展，使植物突變體庫的構建成為研究功能基因組學的重要基礎。擬南芥、水稻等模式植物的功能基因組研究證明，突變體庫的構建在闡明基因功能方面具有重要作用，由于EMS誘變技術的應用，大大推動了植物功能基因組學的發展［5，18-20］。例如用EMS處理水稻優良秈型恢復系縉恢10號，獲得了24份半矮化突變體，為水稻矮化基因資源的豐富和GAs信號傳導途徑的深入研究創造了條件［18］。

4 EMS誘變的前景

隨著EMS誘變技術的發展，使得正向遺傳學主導的植物功能基因組學得到快速發展，圖位克隆技術(Map-based cloning technology)以及定向誘導基因組局部突變技術(Targeting induced local lesions in genomes，TILLING 技術)［15，21-23］是伴隨著 EMS 誘變技術的發展衍生出來的技術。TILLING技術是將誘發產生高頻率點突變的化學誘變方法與PCR篩選技術有機結合，快速有效地從化學誘變劑(如EMS)誘變產生的突變群體中鑒定出點突變。TILLING技術實質上是一種高通量等位變異創制和快速精確鑒定技術，是將傳統的化學誘變方法和突變體高效篩選有效結合的全新反向遺傳學研究方法。其技術原理是將傳統的酶切技術與PCR技術相結合后采用紅外雙色熒光系統進行結果鑒定，從而篩選出相應的突變體。該方法具有高通量、低成本的特性，從而大大加快了植物基因組學的研究進程［22］。

由于EMS誘變隨機性太強、自身突變效率不高、有益突變太少等原因的存在，致使EMS誘變育種無法實現真正意義上的定向誘變育種。近年來，隨著分子遺傳學研究的深入，利用基因工程技術輔助育種是當前國際研究的熱點之一，尤其是CRISP技術，是一種新的對基因組進行高效定點修飾的技術［24-26］。該技術的原理就是利用細菌編碼的酶CAS9能利用引導RNA(guide RNA)分子對特定的DNA片段進行定向切割，在多種類型的細胞和生物體內，這種RNA介導的Cas9酶切作用能夠正常地行使功能，在完整基因組上的特定位點完成切割反應。這樣就可以方便地進行后續的基因組改造工作。細胞通常會通過兩種方式對發生雙鏈斷裂的DNA進行修復，這兩種方式分別是同源重組修復機制(homologous recombination，HR)和非同源末端連接修復機制(non-homologous end joining，NHEJ)，不過在修復的過程中細胞有可能會對修復位點進行修飾，或者插入新的遺傳信息。科學家們利用這種特點開發出了一種能夠對基因組進行特異性定點改造的工具，對細胞乃至整個生物體進行基因組改造。目前已經利用這種技術對細菌、人體細胞、斑馬魚、水稻和擬南芥進行過成功的遺傳學改造工作。

如果改良的個別性狀為隱性基因控制的，采用誘變育種的效果較好。改良多個性狀而且有些性狀為多基因控制的，誘變育種的難度大。在花卉育種中應用誘變育種比較廣泛，主要是花卉的改良要求性狀特異，并非強調要求種子產量高。采用誘變育種較易獲得各種奇特的突變體。因此通過EMS誘變育種與遺傳工程的結合，譬如離體培養結合離體誘變和離體篩選具有十分廣闊的前景。利用單倍體技術與誘變技術結合具有很多優點，在誘變當代既可發現隱性或顯性突變體，還能提高突變率。隨著基因重組技術的發展，便有可能直接對DNA施加誘變處理，獲得離體誘變，實現“定向誘變”的理想。

與其他育種方法一樣，誘變育種還有一定的局限性，它是繼雜交育種之后發展起來的一種新的育種方法，又是創造新的種質資源，豐富育種材料，具有雜交育種及其他育種方法難以代替的特點。學科間的相互滲透已成為當前科學發展的一大趨勢，輻射誘變育種學也必定會在與相鄰學科的相互滲透中得到更快的發展。

5 總結

隨著現代分子生物學的發展，使得功能基因組學得到迅速發展，而通過EMS誘變的方式獲取突變體庫仍是當前最主要的方式之一。該技術具有其它誘變育種方式所不具有的優點，是適合大規模突變的最常用的技術方法。而基于EMS誘變技術衍生出來的基因克隆技術譬如圖位克隆技術、TILLING技術，以及基因定向誘變的CRASPR-CAS技術是后基因組時代重大科技進展。本文對EMS技術的原理方法、技術特點、應用實例以及后期展望進行總結，對EMS技術在現代分子生物學上的應用具有重要意義。

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