MTT方法的優(yōu)化＊

羅奇志，林 琳，王芙艷，余 平

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙，410008)

很多方法都可用于檢測(cè)細(xì)胞增殖及活性，如同位素?fù)饺敕ǎ?，2］、乳酸脫氫酶釋放法［3，4］、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法［5，6］等。MTT 法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，其檢測(cè)結(jié)果與同位素?fù)饺敕ㄓ辛己玫囊恢滦缘珶o(wú)放射性污染，故廣泛應(yīng)用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、觀察細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞增殖的影響、抗腫瘤藥物的體外篩選等研究［7-10］。但常規(guī)MTT法也有不足，尤其是檢測(cè)懸浮細(xì)胞時(shí)影響因素多，重復(fù)性較差。人白血病K562細(xì)胞常用于血液腫瘤的體外研究，并且在自然殺細(xì)胞試驗(yàn)中廣泛用作靶細(xì)胞。本文以K562細(xì)胞為模型，對(duì)MTT法的主要影響因素進(jìn)行篩選，以建立適于測(cè)定K562細(xì)胞活性的優(yōu)化的MTT方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

K562細(xì)胞為本室長(zhǎng)期保存。以含有10%新生牛血清(杭州四季青)的1640(Gibco)于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活性＞95%，完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度備用。

1.2 主要試劑

MTT(Sigma)溶于1×PBS(PH 7.4)為5 mg/mL，0.22 μm濾過(guò)除菌后分裝，避光凍存于－20℃;二甲基亞砜(DMSO，Sigma);酸化異丙醇(用 HCl配成0.04 mol/L);三聯(lián)溶液(100 mL H2O中加入10 g十二烷基磺酸鈉、0.1 mL 10 mol/L的HCl及5 mL異丁醇)。

1.3 MTT法測(cè)定K562細(xì)胞增殖活性的條件篩選

取96孔培養(yǎng)板，四周培養(yǎng)孔不作為試驗(yàn)孔，僅加入PBS 200 μL/孔，余孔按如下條件種板:取K562細(xì)胞依次稀釋為 3.2 ×108、1.6 ×108、0.8 × 108、0.4× 108、0.2 × 108、0.1 × 108/L，分別取 100 μL 加入96孔板，每一篩選條件均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基孔為空白調(diào)零孔。向各板上各組濃度梯度復(fù)孔中分別加入 MTT 5、10、20、30 或 40 μL/孔，于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)4 h后取出，分別按(1)離心去除上清:取96孔板置孔板離心機(jī)上，4000 r/min離心10 min后小心棄去各孔上清，分別加入DMSO或酸化異丙醇100 μL/孔;(2)保留上清:另取培養(yǎng)好的96孔板，直接向各孔中加入三聯(lián)溶液100 μL/孔;將培養(yǎng)板置脫色搖床上震蕩，分別于10 min、2 h、12 h、24 h 后測(cè)定各培養(yǎng)孔 OD570，校正波長(zhǎng)選630 nm;并于倒置相差顯微鏡下觀察formazan(甲臢)結(jié)晶和蛋白沉淀形成情況。

2 結(jié)果

2.1 MTT用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

本試驗(yàn)中選取五種MTT加入量，對(duì)應(yīng)的MTT終濃度分別為 0.238、0.455、0.833、1.154 及 1.429 mg/mL。倒置相差顯微鏡下觀察各試驗(yàn)孔中均有藍(lán)紫色甲臢結(jié)晶形成，形成量無(wú)明顯差異;在加入不同溶劑后檢測(cè)各孔OD值，由圖1可看出，隨著MTT終濃度增大，所測(cè)得OD值呈升高趨勢(shì);但當(dāng)MTT加入量﹥20 μL/孔時(shí)，隨著MTT終濃度增大，所測(cè)得OD值略有下降。

圖1 MTT用量與OD值的關(guān)系(細(xì)胞濃度1.6×108/L)Fig.1 Relation between MTT concentration and absorbance(cell concentration 1.6 ×108/L)

2.2 細(xì)胞濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

由圖2可看出，隨著細(xì)胞濃度增大，所測(cè)得的OD值增高，兩者之間呈正相關(guān);當(dāng)細(xì)胞濃度處于0.8×108～ 0.2×108/L時(shí)，相關(guān)系數(shù)達(dá) 0.997(DMSO組，10 min，P ＜ 0.01)、0.985(酸化異丙醇組，2 h，P＜0.01)和 0.998(三聯(lián)溶液組，12 h，P ＜0.01)。

圖2 細(xì)胞濃度與OD值的關(guān)系Fig.2 Relation between cell concentration and absorbance

2.3 離心去上清對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

本實(shí)驗(yàn)中采用了三種常用甲臢溶劑，其中DMSO及酸化異丙醇在加入前需先去除培養(yǎng)孔內(nèi)上清。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是采用倒扣培養(yǎng)板法還是逐孔吸出法去除培養(yǎng)上清，總會(huì)有少量甲臢結(jié)晶損失。經(jīng)測(cè)定各重復(fù)孔OD570值也證實(shí)，去除上清后各重復(fù)孔的CV值在0.08左右;而未去除上清的(三聯(lián)溶液組)重復(fù)孔CV值不高于0.05。

2.4 不同溶劑、不同作用時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

在分別加入三種甲臢溶劑后的不同時(shí)間，鏡下觀察可見(jiàn)DMSO組各孔內(nèi)甲臢結(jié)晶迅速溶解，10 min已溶解完全，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各孔顏色逐漸加深，但未見(jiàn)明顯蛋白沉淀;酸化異丙醇組各孔內(nèi)甲臢結(jié)晶在30 min內(nèi)溶解完全，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各孔顏色逐漸變淺，且出現(xiàn)逐漸增多的絮狀沉淀;三聯(lián)液組各孔內(nèi)甲臢結(jié)晶在12 h內(nèi)完全溶解，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各孔顏色無(wú)明顯改變，且未見(jiàn)明顯蛋白沉淀。分別于加入三種甲臢溶劑后10 min、2 h、12 h、24 h測(cè)定各培養(yǎng)孔OD570可見(jiàn)，DMSO組OD570值在2 h之內(nèi)無(wú)明顯變化;酸化異丙醇組在各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得OD570值有較明顯波動(dòng);三聯(lián)液組在12 h之后所測(cè)得的OD570值無(wú)明顯變化(圖3)。

圖3 不同溶劑、不同作用時(shí)間與OD值的關(guān)系Fig.3 Relation between solution and absorbance at different time point

3 討論

基于細(xì)胞能量代謝水平與DNA合成水平相平行的原理，Mosmann于1983年首創(chuàng)四唑鹽比色法(MTT法)用于檢測(cè)IL-2的生物學(xué)活性［11］。MTT法因其簡(jiǎn)單、快速、敏感性好等而廣泛應(yīng)用于臨床和科研，同時(shí)，針對(duì)MTT法重復(fù)性較差、結(jié)果精確度易受甲臢溶劑不穩(wěn)定性的影響等缺點(diǎn)，研究者們?cè)诓粩鄬?duì)特定實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行改良優(yōu)化及拓展其應(yīng)用［12-16］。本實(shí)驗(yàn)以K562為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)使用MTT法檢測(cè)懸浮細(xì)胞增殖活性的相關(guān)影響因素進(jìn)行篩選優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100 μL/孔細(xì)胞培養(yǎng)體系中5 mg/mL的MTT用量以不超過(guò)20 μL/孔為宜;為保證甲臢結(jié)晶形成量與細(xì)胞數(shù)呈良好線性關(guān)系，待測(cè)細(xì)胞濃度應(yīng)取0.8×108～0.2×108/L。DMSO、酸化異丙醇及三聯(lián)溶液是最為常用的三種甲臢溶劑，前兩者更多應(yīng)用于貼壁細(xì)胞，但在本實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，由于在加入這兩種溶劑之前需要先去除培養(yǎng)孔中上清，盡管使用了孔板離心機(jī)離心，仍舊不能避免細(xì)胞及甲臢結(jié)晶的損失，因而影響孔間重復(fù)性及結(jié)果精密度;而采用三聯(lián)溶液不需去除原培養(yǎng)上清，檢測(cè)效果更好。在檢測(cè)時(shí)間上，DMSO、酸化異丙醇因能迅速溶解甲臢結(jié)晶而具有檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)，尤其是DMSO，10 min即可上機(jī)檢測(cè)，酸化異丙醇需在加入后30 min左右檢測(cè);但兩種溶劑的穩(wěn)定性有限，DMSO需在2 h之內(nèi)檢測(cè)，酸化異丙醇則很快褪色，且產(chǎn)生蛋白沉淀影響結(jié)果測(cè)定。三聯(lián)溶液的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于前兩者，但需要反應(yīng)過(guò)夜(12 h)后才能檢測(cè)。因此，在檢測(cè)懸浮細(xì)胞K562的增殖活性時(shí)，若不考慮時(shí)間成本，建議選擇三聯(lián)溶液作為甲臢溶劑;若需快速獲得結(jié)果，建議選擇DMSO作為甲臢溶劑。

［1］ARA J1，DE MONTPELLIER S.Hypoxic-preconditioning enhances the regenerative capacity of neural stem/progenitors in subventricular zone of newborn piglet brain［J］.Stem Cell Res，2013，11(2):669-686.

［2］CHINCHAR E，MAKEY K L，GIBSON J，et al.Sunitinib significantly suppresses the proliferation，migration，apoptosis resistance，tumor angiogenesis and growth of triple-negative breast cancers but increases breast cancer stem cells［J］.Vasc Cell，2014，6:12.

［3］ALBERT I，HEFTI M，LUGINBUEHL V.Physiological oxygen concentration alters glioma cell malignancy and responsiveness to photodynamic therapy in vitro［J］.Neurol Res，2014.［Epub ahead of print］

［4］SZKARADKIEWICZ A K，KARPI?SKI TM1，SZKARADKIEWICZ A.Effect of novobiocin on the viability of human gingival fibroblasts(HGF-1)［J］.BMC Pharmacol Toxicol，2014，15:25.

［5］DIETEL B 1，MUENCH R 2，KUEHN C，et al.MCS-18，a natural product isolated from Helleborus purpurascens，inhibits maturation of dendritic cells in ApoE-deficient mice and prevents early atherosclerosis progression［J］.Atherosclerosis，2014，235(2):263-272.

［6］QUANDT D，JASINSKI-BERGNER S，MULLER U，et al.Synergistic effects of IL-4 and TNF alpha on the induction of B7-H1 in renal cell carcinoma cells inhibiting allogeneic T cell proliferation［J］.J Transl Med，2014，12(1):151.

［7］李上標(biāo)，裴淑艷，蔣超，等.MTT比色法研究應(yīng)用進(jìn)展［J］.西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2013(03):83-85.LI Shangbiao，PEI Shuyan，JIANG Chao，et al.Progress in research and application of MTT colorimetric method［J］.Journal of Northwest University For Nationalities，2013(03):83-85.

［8］GU Z，DING G，LIANG K，et al.TESTIN suppresses tumor growth and invasion via manipulating cell cycle progression in endometrial carcinoma［J］.MedSciMonit， 2014， 20:980-987.

［9］CHEN G，YUE A，RUAN Z，et al.Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells do not undergo malignant transformation during Long-Term culturing in serum-free medium［J］.PLoS One，2014，9(6):e98565.

［10］LI J，CUI Y，WANG Q，et al.The proliferation of malignant melanoma cells could be inhibited by ranibizumab via antagonizing VEGF through VEGFR1［J］.Mol Vis，2014，20:649-660.

［11］MOSMANNT.Rapid colorimetric assay for cell growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assay［J］.Immunol Methods，1983，65(1):55-63.

［12］POUVREAU JB1，GAUDIN Z，AUGER B，et al.A highthroughput seed germination assay for root parasitic plants［J］.Plant Methods，2013，9(1):32.

［13］吳窈畫，談書華，范超超，等.MTT法檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的主要影響因素分析［J］.微生物學(xué)雜志，2011，31(3):67-72.WU Yao，TAN Shuhua，F(xiàn)AN Chaochao，et al.The main factors affecting the detection of bacterial cell counts in MTT analysis［J］.Journal of Microbiology，2011，31(3):67-72.

［14］陳強(qiáng)，張進(jìn)華，陳建庭，等.改良MTT藥敏分析在成骨肉瘤個(gè)體化治療中的意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011，19(01):153-155.CHEN Qiang，ZHANG Jinhua，CHEN Jianting，et al.The significance of improved MTT assay in individualized therapy for osteosarcoma［J］.Modern Cancer Medicine，2011，19(01):153-155.

［15］李金清.MTT法淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)最佳條件的篩選研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011(01):107-108.LI Jinqing.Screening of optimum MTT conditions for lymphocyte transformation tests［J］.Heilongjiang Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2011(01):107-108.

［16］GANOT N，MEKER S，REYTMAN L，et al.Anticancer metal complexes:synthesis and cytotoxicity evaluation by the MTT assay［J］.Vis Exp，2013，10(81):e50767.doi:10.3791/50767.