家蠶墨蝶呤還原酶基因的體外表達(dá)及酶活性研究＊

李聞天，龔美霞，戴偉宏，張 蕾，王文靜，劉朝良，孟 艷

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036)

家蠶(Bombyx mori)基因組框架圖、精細(xì)圖以及各種數(shù)據(jù)庫(kù)的相繼建立和不斷完善，為發(fā)掘和鑒定家蠶基因、研究基因的生物學(xué)功能及應(yīng)用前景奠定了良好的信息平臺(tái)基礎(chǔ)［1-3］。lemon(lem)是一種典型的黃體色家蠶突變體，其幼蟲體表富含墨蝶呤(sepiapterin，SP)［4］。SP屬于喋啶類化合物，是 GTP 分解代謝途徑的中間產(chǎn)物。在高等動(dòng)物中，SP是補(bǔ)救途徑合成四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)的前體，經(jīng)墨蝶呤還原酶(sepiapterin reductase，SPR)和二氫葉酸還原酶(dihydrobiopterin reductase，DHFR)催化完成(圖 1)［5，6］。

SPR是以NADPH為輔酶催化蝶啶衍生物代謝的醛酮還原酶［7］，由GTP分解到BH4生成的從頭合成途徑中，SPR是催化最后一步反應(yīng)的必需酶［7］，對(duì)于生物體合成BH4具有非常重要的生理功能。BH4是芳香族氨基酸羥化酶的必需輔酶，也是一氧化氮合酶的重要輔助因子。BH4的合成不足會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏以及細(xì)胞內(nèi)皮功能障礙，引發(fā)多種神經(jīng)性生理代謝疾病［8-10］。

圖1 四氫生物蝶呤的補(bǔ)救合成途徑Fig.1 Salvage pathway of tetrahydrobiopteri synthesis.BH2，dihydrobiopterin，DHFR，dihyrofolate reductase

我們的前期研究表明，家蠶SPR(BmSPR，Gen-Bank登錄號(hào):AB465548)基因(BmSpr)的全長(zhǎng)ORF為801 bp。與哺乳動(dòng)物 SPR類似，BmSPR是家蠶體內(nèi)合成BH4的重要酶之一，其活性的嚴(yán)重缺乏會(huì)導(dǎo)致幼蟲因BH4的合成不足而死亡［11］。家蠶lem突變體是提取和純化獲得天然 SP的重要遺傳資源。為了將從lem中大量提純的SP應(yīng)用于BH4的體外生物合成研究，本文對(duì)重組質(zhì)粒pET-24b-BmSpr的原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，得到了穩(wěn)定表達(dá)BmSPR融合蛋白的實(shí)驗(yàn)條件，并對(duì)純化獲得的重組蛋白進(jìn)行了酶學(xué)鑒定及活性分析。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

重組質(zhì)粒6×His pET-24b-BmSpr由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建;E.coli感受態(tài)細(xì)胞 Rosetta(DE3)和BL21(DE3)購(gòu)自北京全式金公司;PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑購(gòu)自TaKaRa公司;Anti-His Antibody、羊抗鼠 IgG-HRP、HRP-DAB底物顯色試劑盒為 Tiangen公司產(chǎn)品;蛋白純化、蛋白定量試劑盒分別為 QIAGEN公司和上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品;PD-10蛋白脫鹽柱購(gòu)自GE公司;Immobilon-P PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品;SP標(biāo)準(zhǔn)品及 NADPH購(gòu)自 Sigma公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌落 PCR

1.2.1 檢測(cè)陽(yáng)性克隆的引物序列

正向引物:M13F，5＇-GTTTTCCCAGTCACGAC-3＇;

反向引物:M13R，5＇-CAGGAAACAGCTATGAC-3＇。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系 25 μL反應(yīng)體系中含10×擴(kuò)增緩沖液 2.5 μL，0.3 U Tag 酶和 0.2 ～0.5 μg 模板 DNA，dNTP Mix、正反向引物的終濃度分別為0.8 mmol/L、0.4 μmol/L 和 0.4 μmol/L，最后用 ddH2O補(bǔ)齊。

1.2.3 PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)定 95℃預(yù)變性10 min，反應(yīng)25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性55 s，54℃退火58 s，72℃延伸1 min。循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)。

1.3 優(yōu)化重組蛋白表達(dá)條件

運(yùn)用熱擊法將pET-24b-BmSpr重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)及Rosetta(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞，37℃，150 r/min活化一個(gè)小時(shí)后，將100 μL菌液均勻涂布于 LB 平板(含15 μg/mL Kanamycin)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取經(jīng)菌落PCR鑒定的陽(yáng)性克隆，接種到含Kanamycin的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)至 OD600≈0.5時(shí)，加入 1.0 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，對(duì)照組不加 IPTG。誘導(dǎo)4 h后，收集菌體，超聲波破碎，離心，分別收集上清和細(xì)胞沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)［12］，分析不同菌株中重組BmSPR蛋白的表達(dá)情況。

以1.0 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)濃度，對(duì)照組不加IPTG，分別使用4℃、16℃、28℃和37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后，收集菌體總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，分析不同誘導(dǎo)溫度下重組BmSPR蛋白在Rosetta(DE3)宿主菌中的表達(dá)情況。使用不同濃度梯度的 IPTG(0.2、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2 、1.5 和 2.0 mmol/L)和不同誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間(0、1、2、3、4、5 和 6 h)，于37℃誘導(dǎo)重組蛋白在Rosetta(DE3)中的表達(dá)。收集菌體總蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)，分析重組蛋白在不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)情況。

1.4 大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白

在37℃培養(yǎng)條件下，用250 mL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)含重組質(zhì)粒pET-24b-BmSpr的E.coli Rosetta(DE3)的陽(yáng)性菌株，用 0.4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，最后破碎細(xì)胞收集上清液，進(jìn)行 SDSPAGE檢測(cè)。

1.5 蛋白純化及免疫印跡檢測(cè)

擴(kuò)大培養(yǎng)后，4℃ 8000 r/min離心10 min收集E.coli細(xì)胞，超聲破碎，并收集細(xì)胞破碎上清液。參照說(shuō)明書，用Ni-NTA親和層析柱(QIAGEN)對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。經(jīng)10%SDS-PAGE電泳檢測(cè)確認(rèn)后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以His-Tag單克隆抗體(Tiangen)為一抗，羊抗鼠IgG-HRP抗體(Tiangen)為二抗，進(jìn)行Western blot分析，然后參照HRP-DAB顯色試劑盒 (Tiangen)說(shuō)明書進(jìn)行顯色反應(yīng)［13］

1.6 酶活特性分析

使用BCA法試劑盒(上海生工)對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行定量，并參照Katoh［14］的方法，進(jìn)行SPR酶活性分析。反應(yīng)體系為0.1 mL(含100 mmol/L磷酸鉀緩沖液 pH 6.4，SP 50 μmol/L，NADPH 100 μmol/L)，加入0.2 μg重組酶蛋白，37℃反應(yīng) 10 min后，在420 nm處測(cè)定底物SP的OD值變化。對(duì)照組則不加重組蛋白。根據(jù)反應(yīng)前后SP吸光值的變化和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活單位。酶活力單位定義為:每分鐘還原1 nmol SP所需的酶量 (nmol/min·μg-1)。設(shè)定不同梯度的溫度(20-90℃)和反應(yīng)液 pH(20 mmol/L Britton-Robinson buffer，pH 2.0-12.0)，檢測(cè)不同溫度及pH對(duì)酶活性的影響，探究重組蛋白的最適反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmSPR體外表達(dá)條件的優(yōu)化

篩選轉(zhuǎn)化成功的重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落PCR排除假陽(yáng)性，并經(jīng)測(cè)序(上海生工)確認(rèn)序列準(zhǔn)確無(wú)誤，用IPTG(1.0 mmol/L)誘導(dǎo)重組子在不同宿主細(xì)胞的表達(dá)。菌落PCR結(jié)果如圖2所示，PCR產(chǎn)物大小約為800 bp，與預(yù)期相符。SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在E.coli菌株 Rosetta(DE3)及BL21(DE3)的細(xì)胞破碎上清液中均出現(xiàn)大小約為30 kDa的特異性條帶，與目的蛋白的預(yù)測(cè)分子量相符，且兩菌株之間的表達(dá)量沒有明顯差異 (圖3)，在細(xì)胞沉淀中目的蛋白的表達(dá)量相對(duì)較少(數(shù)據(jù)未附)。

圖2 陽(yáng)性克隆的菌落PCR鑒定Fig.2 Identification of pET-24b-BmSpr positive transformants by colony PCR

以Rosetta(DE3)為宿主菌，使用1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，分別以4℃、16℃、28℃和37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，分析重組蛋白在不同誘導(dǎo)溫度條件下的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4所示，無(wú) IPTG誘導(dǎo)時(shí)，SDS-PAGE未檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，37℃誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達(dá)量明顯高于其他誘導(dǎo)溫度。

以Rosetta(DE3)為宿主菌，在37℃的培養(yǎng)條件下，通過(guò)改變IPTG濃度 (0.2-2.0 mmol/L)及培養(yǎng)時(shí)間(1-6 h)，分析重組蛋白在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的表達(dá)情況。結(jié)果如圖5所示，無(wú)IPTG誘導(dǎo)時(shí)，SDS-PAGE未檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，而不同IPTG誘導(dǎo)濃度(圖5A)之間及不同誘導(dǎo)時(shí)間(圖5B)之間對(duì)目的蛋白的表達(dá)量幾乎沒有影響，表明重組蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)能夠穩(wěn)定表達(dá)。

圖3 重組BmSPR在不同E.coli菌株中的表達(dá)情況Fig.3 Expression of recombinant BmSPR in different E.coli strains

圖4 不同誘導(dǎo)溫度下重組BmSPR表達(dá)量的SDSPAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant protein at different inducing temperature

圖5 不同濃度IPTG(A)及不同培養(yǎng)時(shí)間(B)對(duì)重組BmSPR誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the induced expression of recombinant BmSPR by different concentrations of IPTG(A)and different incubation time(B)

2.2 BmSPR蛋白的純化及 Western blot檢測(cè)

根據(jù)上述表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果，以E.coli Rosetta(DE3)菌株為宿主菌，用 0.4 mmol/L IPTG大量誘導(dǎo)BmSPR的體外表達(dá)，培養(yǎng)3 h后破碎細(xì)胞，收集上清液蛋白，SDS-PAGE確認(rèn)了重組蛋白的表達(dá)(圖 6A)。

用Ni-NTA親和層析柱對(duì)重組BmSPR蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE檢測(cè)得到符合預(yù)期分子量大小的單一條帶，初步說(shuō)明重組蛋白純化效果較佳 (圖6B)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)且純化過(guò)的蛋白得到特異性條帶，而對(duì)照組(未經(jīng)誘導(dǎo))沒有檢出信號(hào)，再次證明了所表達(dá)和純化的蛋白為目的重組蛋白 BmSPR(圖6C)。

圖6 重組BmSPR的表達(dá)(A)、純化(B)與鑒定(C)Fig.6 SDS-PAGE analysis of the expression(A)and purification(B)and western blot analysis of the identification(C)of recombinant BmSPR

2.3 BmSPR的酶活性分析

如圖7A所示，BmSPR在40-70℃的溫度范圍內(nèi)，保持較高的活性，50℃為最適反應(yīng)溫度。為分析pH對(duì)BmSPR活性的影響，使用終濃度為50 mmol/L不同 pH(2.0-12.0)的 Britton-Robinson buffer，酶蛋白加入各反應(yīng)體系，于37℃反應(yīng)10 min后計(jì)算酶活性。如圖7B所示，BmSPR在 pH 4-6之間表現(xiàn)出較高的酶活性，pH 5為最適pH值。

圖7 不同反應(yīng)溫度(A)和pH(B)對(duì)BmSPR酶活性的影響Fig.7 Relative enzymatic activities of BmSPR at different reaction temperatures(A)and pH values(B)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用 E.coli不同菌株 (圖3)，通過(guò)改變誘導(dǎo)溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)家蠶SPR的體外表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化 (圖4，圖5)，最終選用 E.coli Rosetta(DE3)對(duì)其進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)分析，SDS-PAGE和 Western blot的檢測(cè)結(jié)果表明BmSPR融合蛋白能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)(圖6)。以SP為反應(yīng)底物，用分光光度法分析所純化蛋白的酶活性的數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)溫度為50℃、pH值為5時(shí)，BmSPR對(duì)SP表現(xiàn)出良好的催化活性(圖7)，為通過(guò)表達(dá)重組BmSPR的方式，開展體外合成制備BH4的課題研究提供了重要依據(jù)。

作為芳香族氨基酸羥化酶和一氧化氮合酶的重要輔酶，BH4的合成缺陷會(huì)引起肌張力低下、不明原因的高熱、發(fā)育遲緩、腦脊液中神經(jīng)遞質(zhì)代謝產(chǎn)物的濃度偏低等神經(jīng)系統(tǒng)疾病［15，16］;同時(shí)也是導(dǎo)致高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等內(nèi)皮功能異常的重要原因［16］。口服BH4已被作為臨床治療其中某些疾病的常規(guī)方案［17-19］。然而經(jīng)化工合成市售的 BH4價(jià)格非常昂貴［18］。因此，低耗高效的BH4生產(chǎn)工藝的開發(fā)創(chuàng)立顯得十分必要［20］。隨著與BH4合成相關(guān)的酶如 GTPCHI［21］、PTPS［22］、DHPR［23］、SPR［11，24］以及DHFR［25］等的研究日益增多，酶基因的克隆與功能鑒定，蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的探明，使得BH4合成代謝的調(diào)控通路愈發(fā)清楚。這些研究一方面有助于加速對(duì)BH4缺乏癥實(shí)現(xiàn)基因治療的進(jìn)程，另一方面為非化工途徑合成BH4的應(yīng)用基礎(chǔ)研究奠定必要的理論基礎(chǔ)。

原核表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最普遍的基因工程蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有操作簡(jiǎn)單、高效低廉等明顯優(yōu)勢(shì)［26］。我們利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，獲得了純度較高、催化活性較好的重組 BmSPR(圖6，7)和BmDHFR［25］。家蠶 lem突變體的幼蟲體表沉積大量的SP［4，27］，本課題組已建立了從 lem 蠶高效地分離純化SP的實(shí)驗(yàn)體系［27］，并且對(duì)BH4的補(bǔ)救合成途徑所需要的兩個(gè)酶進(jìn)行了分子克隆和功能分析［11，25］。下一步我們打算利用從lem突變體大量提取的SP為底物，篩選共表達(dá)BmSPR和BmDHFR的工程菌，進(jìn)行體外合成制備BH4的研究試驗(yàn)，以期獲得一種較為簡(jiǎn)便有效的合成BH4的方法。

［1］WANG J，XIA Q Y，HE X，et al.SilkDB:a knowledgebase for silkworm biology and genomics［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(1):399-402.

［2］XIA Q Y，ZHOU Z Y，LU C，et al.A draft sequence for the genome of the domesticated silkworm(Bombyx mori)［J］.Science，2004，306(5703):1937-1940.

［3］XIA Q Y，GUO Y，ZHANG Z，et al.Complete resequencing of 40 genomes reveals domestication events and genes in silkworm(Bombyx)［J］.Science，2009，326(5951):433-436.

［4］TSUSUE M，AKINO M.Yellow pterins in mutant lemon of silkworm and mutant sepia of D.melanogaster［J］.J Zool Mag(Tokyo)，1965，74:336-341.

［5］THONY B，AUERBACH G，BLAU N.Tetrahydrobiopterin biosynthesis，regeneration and functions［J］.Biochem J，2000，347(1):1-16.

［6］CURTIUS H C，HEINTEL D，GHISLA S，et al.Tetrahydrobiopterin biosynthesis-Studies with specifically labeled(2H)NAD(P)H and 2H2O and of the enzymes involved［J］.Eur J Biochem，1985，148(3)，413-419.

［7］FAN C L，BROWN G M.Partial purification and some properties of biopterin synthase and dihydropterin oxidase from Drosophila melanogaster［J］.Biochem Genet，1979，17(3-4):351-369.

［8］BLAU N，THONY B .Tetrahydrobiopterin in biomedical research ［J］.Inherit Metab Dis，2009，3(2):1-2

［9］SCHERER-OPPLIGER T，MATASOVIC A，LAUFS S，et al.Dominant negative allele(N47D)in a compound heterozygote for a variant of 6-pyruvoyltetrahydropterin synthase deficiency causing transient hyperphenylalaninemia ［J］. Hum Mutat，1999，13(4):286-289.

［10］KIM H L，CHOI Y K，KIM D H，et al.Tetrahydropteridine deficiency impairs mitochondrial function in Dictyostelium discoideum Ax2 ［J］.FEBS Lett，2007，581(28):5430-5434.

［11］MENG Y，KATSUMA S，DAIMON T，et al.The silkworm mutant lemon(lemon lethal)is a potential insect model for human sepiapterin reductase deficiency［J］.J Biol Chem，2008，284(17):11698-11705.

［12］LAEMMLI U K .Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，5259(227):680-685.

［13］ZHU B J，WU X Z.Characterization and function of CREB homologue from Crassostrea ariakensis stimulated by rickettsialike organism［J］.Dev Comp Immunol，2008，32(12):1572-1581.

［14］KATOH S.Sepiapterin reductase from horse liver:purification and properties of the enzyme ［J］.Arch Biochem Biophys，1971，146(1):202-214.

［15］THONY B，LEIMBACHER W，BLAU N，et al.Hyperphenylalaninemia due to defects in tetrahydrobiopterin metabolism-Molecular characterization of mutations in 6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase［J］.Am J Hum Genet，1994，54(5):782-79.

［16］WERNER-FELMAYER G，GOLDERER G，WERNER E R.Tetrahydrobiopterin biosynthesis，utilization and pharmacological effects［J］.Curr Drug Metab，2002，3(2):159-173.

［17］DHILLON B，BADIWALA M V，MAITLAND A，et al.Tetrahydrobiopterin attenuates homocysteine induced endothelial dysfunction［J］.Mol Cell Biochem，2003，247(1-2):223-227.

［18］SHINOZAKI K，NISHIO Y，OKAMURA T，et al.Oral administration of tetrahydrobiopterin prevents endothelial dysfunction and vascular oxidative stress in the aortas of insulin-resistant rats［J］.J Circulation，2002，87(7):566-573.

［19］HIGASHI Y，SASAKI S，NAKAGAWA K，et al.Tetrahydrobiopterin enhances forearm vascular response to acetylcholine in both normotensive and hypertensive individuals［J］.Am J Hypertens，2002，15(4):326-332.

［20］YAMAMOTO K，KATAOKA E，MIYAMOTO N，et al.Genetic engineering of Escherichia coli for production of tetrahydrobiopterin［J］.Metab Eng，2003，5(4):246-254.

［21］HATAKEYAMA K，INOUE I，HARADA T，et al.Cloning and sequencing of cDNA encoding rat GTP cyclohydrolase I.The first enzyme of the tetrahydrobiopterin biosynthetic pathway［J］.J Biol Chem，1991，266(2):765-769.

［22］THONY B，LEIMBACHER W，BURGISSER D，et al.Human 6-pyruvoyltetrahydropterin synthase:cDNA cloning and heterologous expression of the recombinant enzyme［J］.Biochem Biophys Res Co，1992，189(3):1437-1443.

［23］PARK D，PARK S，YIM J.Molecular characterization of Dro-sophila melanogaster dihydropteridine reductase［J］.Biochim Biophys Acta，2000，1492(1):247-251.

［24］MANU SHARMA，DEMETRIUS M MARAGANORE，JOHN P A，IOANNIDIS，et al.Role of sepiapterin reductase gene at the PARK3 locus in Parkinson’s disease［J］.Neurobiol Aging，2011，32:2108(e1-e5).

［25］WANG W J，GAO J S，WANG J，et al.Cloning，expression and enzymatic properties analysis of dihydrofolate reductase gene from the silkworm，Bombyx mori［J］.Molecular Biology Reports，2012，39(12):10285-10291.

［26］NUC P，NUC K.Recombinant protein production in Escherichia coli［J］.Postepy Biochem，2006，52(4):448-456.

［27］GAO J S，WANG J，WANG W J，et al.Isolation，purification and identification of an important pigment sepiapterin from integument of the lemon mutant of silkworm，Bombyx mori［J］.Journal of Insect Science，2013，13:118.