生物傳感器法測(cè)定麥芽汁中賴氨酸含量的研究＊

馮 東，王丙蓮

(1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250014;2.山東省科學(xué)院生態(tài)研究所，山東 濟(jì)南 250014;3.山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

大麥含各種必需氨基酸，而賴氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸含量較低，為大麥的限制性氨基酸。而賴氨酸作為蛋白質(zhì)的第一限制氨基酸，其含量是判定大麥優(yōu)質(zhì)品種與否的一個(gè)重要指標(biāo)。大麥麥芽汁是啤酒生產(chǎn)的主要原料，其成分分析對(duì)于啤酒生產(chǎn)工藝研究具有重要意義。研究報(bào)導(dǎo)麥芽汁中的游離氨基酸是影響酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)酵的重要指標(biāo)，賴氨酸和蛋氨酸是麥芽汁發(fā)酵中的關(guān)健氨基酸，補(bǔ)加賴氨酸對(duì)酵母發(fā)酵水平及酵母發(fā)酵對(duì)氨基酸的利用的影響非常明顯［1］。因此，測(cè)定麥芽汁中的賴氨酸含量，對(duì)啤酒生產(chǎn)有重要的指導(dǎo)作用。隨著氨基酸自動(dòng)分析儀的問(wèn)世，氨基酸測(cè)定技術(shù)已發(fā)展到進(jìn)樣、分離、檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理全部自動(dòng)化的程度。但大批量樣品的賴氨酸含量測(cè)定受時(shí)間、經(jīng)費(fèi)或儀器設(shè)備條件限制。本研究中，我們采用賴氨酸生物傳感分析儀測(cè)定麥芽汁中的賴氨酸含量，并對(duì)其的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明該生物傳感器能夠快速、準(zhǔn)確的測(cè)定麥芽汁中賴氨酸含量，從而為賴氨酸含量檢測(cè)提供一種快速、有效的方法，為麥芽汁做原料的酵母的高效發(fā)酵提供技術(shù)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

賴氨酸氧化酶，美國(guó)Sigma公司;賴氨酸:美國(guó)Sigma公司;牛血清蛋白(BSA Sigma進(jìn)口分裝)、戊二醛:日本酵母工業(yè)株式會(huì)社，其他試劑均為分析純。

SBA-40E型生物傳感分析儀:山東省科學(xué)院生物研究所研制

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

賴氨酸氧化酶酶膜安裝于生物傳感分析儀(SBA-40E)，分析儀反應(yīng)池側(cè)面裝有過(guò)氧化氫電極。定量的賴氨酸樣品溶液注入反應(yīng)池后，有下列酶反應(yīng)進(jìn)行:賴氨酸+O2+H2O6-氨基-2-氧代己酸+H2O2+NH3

在一定時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)生的H2O2量與賴氨酸的含量成正比，由過(guò)氧化氫電極產(chǎn)生相應(yīng)的電流信號(hào)，在生物傳感分析儀的屏幕上以數(shù)字顯示并自動(dòng)記錄和打印，顯示值和賴氨酸含量有線性關(guān)系。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 賴氨酸氧化酶酶膜制備 采用美國(guó)Sigma公司的賴氨酸氧化酶，采用酶固定化技術(shù)加工制成賴氨酸酶膜［2］，靜置干燥，備用。

1.3.2 賴氨酸梯度濃度配制 準(zhǔn)確稱量賴氨酸分別溶于蒸餾水，配制濃度依次為 0、1、2、3、4、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mg/100 mL梯度濃度賴氨酸溶液，靜置備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將賴氨酸氧化酶酶膜安裝于SBA-40E型生物傳感分析儀，依據(jù)分析儀的操作步驟，以精確配制的100 mg/100 mL賴氨酸溶液對(duì)分析儀進(jìn)行標(biāo)定，并依次檢測(cè)梯度濃度賴氨酸溶液，每個(gè)濃度重復(fù)3次。以賴氨酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，賴氨酸氧化酶相對(duì)酶活性為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢驗(yàn)賴氨酸氧化酶對(duì)賴氨酸的線性響應(yīng)規(guī)律及檢測(cè)限。

1.3.4 麥芽汁樣品處理及測(cè)定 以18°P的原麥芽汁為待測(cè)樣品，取一定量的麥芽汁于5000 r/min離心5 min，取其上清液以濾紙過(guò)濾，濾液用蒸餾水按相應(yīng)比例稀釋，后依據(jù)分析儀提示準(zhǔn)確吸取25 μL稀釋液注入反應(yīng)池。20 s后分析儀自動(dòng)顯示并打印結(jié)果，結(jié)合稀釋倍數(shù)即可分析麥芽汁中賴氨酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍及檢出限確定

賴氨酸氧化酶相對(duì)酶活性對(duì)賴氨酸含量的響應(yīng)曲線見(jiàn)圖1(A，B)。由圖1(A)可知，賴氨酸濃度在0-200 mg/100 mL范圍內(nèi)，賴氨酸氧化酶活性與賴氨酸濃度線性關(guān)系較差，其回歸方程為:Y=94.93785+14.03916X，相關(guān)系數(shù) R2=0.97203。以 2、3、4、5、10、20、40、60、80、100 mg/100 mL 賴氨酸濃度繪制工作曲線圖1(B)，賴氨酸氧化酶活性與賴氨酸濃度相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，二者呈良好線性關(guān)系。由此可認(rèn)為，基于賴氨酸氧化酶活性原理的生物傳感器法檢測(cè)賴氨酸的線性范圍為2～100 mg/100 mL，檢出限為2 mg/100 mL。

2.2 專一性試驗(yàn)

麥芽汁中含有20種基本氨基酸中的19種，這些氨基酸的降解有序并基于一定的模式，氨基酸按著酵母的同化方式可分為四類(見(jiàn)表1)［3］。

取麥芽汁中共存的幾種游離氨基酸，以及葡萄糖、乳酸等作為干擾物，驗(yàn)證生物傳感器法(SBA-40E)檢測(cè)賴氨酸含量的專一性和抗干擾能力。配制谷氨酸、精氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、葡萄糖、L-乳酸、2，3-戊二酮等干擾濃度為 100 mg/100 mL，以濃度為100 mg/100 mL的賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作對(duì)比，分別重復(fù)測(cè)試4次，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 賴氨酸氧化酶活性與賴氨酸濃度的線性關(guān)系Fig.1 Linear relationship between the activity of lysine oxidase and lysine concentration

表1 以酵母同化速率為依據(jù)的麥芽汁中氨基酸分類Tab.1 Classification of amino acids in wort on the base of the yeast assimilation rate

表2 專一性試驗(yàn)(n=4)Tab.2 Specificity test for lysine

由表2可以看出，基于固定化賴氨酸氧化酶的生物傳感分析儀能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到賴氨酸濃度，而對(duì)其它共存于麥芽汁中的氨基酸等均無(wú)明顯響應(yīng)，說(shuō)明該傳感器法的對(duì)賴氨酸的檢測(cè)專一性很高。能夠有效排除麥芽汁中共存的亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸等具有相近化學(xué)顯色反應(yīng)物質(zhì)的干擾，確保其測(cè)定準(zhǔn)確性和精確性［4］。

2.3 最適反應(yīng)pH試驗(yàn)

不同pH值的測(cè)定環(huán)境對(duì)賴氨酸氧化酶的催化活性、穩(wěn)定性及壽命均有影響，從而影響賴氨酸含量的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)選用 pH 值為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12的 0.2 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，以 100 mg/100 mL賴氨酸溶液作為反應(yīng)底物，檢驗(yàn)賴氨酸酶膜催化反應(yīng)的的最適pH值，及不同pH值環(huán)境中酶膜壽命，結(jié)果如圖2(A、B)。pH 6～8時(shí)賴氨酸氧化酶催化活性較高，而pH 7時(shí)酶活性最高(圖2 A)，且pH7的緩沖液中賴氨酸氧化酶酶膜壽命較長(zhǎng)，工作40 d時(shí)酶活性降低不明顯(圖2 B)，而酸堿環(huán)境中酶膜活性明顯降低，甚至失活。綜上，本測(cè)定系統(tǒng)的最適反應(yīng) pH值7.0。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取分析純賴氨酸1.55 g，蒸餾水定容至100 mL，配制賴氨酸質(zhì)量濃度為15.5 mg/mL。利用賴氨酸生物傳感分析儀(SBA-40E)進(jìn)行含量測(cè)定，重復(fù)5次，依據(jù)空白加標(biāo)回收率計(jì)算公式:P=(測(cè)定值÷理論值)×100%，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明該方法測(cè)定賴氨酸含量的回收率良好，準(zhǔn)確度較高。

表3 回收實(shí)驗(yàn)Tab.3 Recovery experiment for lysine

圖2 pH值對(duì)賴氨酸氧化酶酶膜活性(A)及酶膜壽命(B)的影響Fig.2 Effect of pH on the activity(A)and life(B)of lysine oxidase membrane

2.5 生物傳感器法與其他測(cè)定方法對(duì)比試驗(yàn)

為了確定生物傳感器法與氨基酸分析儀法、染料結(jié)合法(DBL法國(guó)標(biāo)GB4801-4)、液相色譜方法測(cè)定結(jié)果是否有較大差異，我們?nèi)?個(gè)麥芽汁樣品(a、b)，每個(gè)樣品分別用生物傳感分析儀(SBA-40E)、氨基酸分析儀、高效液相色譜(HPLC)、DBL法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)測(cè)定重復(fù)6次，分別于SBA-40E比較，結(jié)果進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 對(duì)比試驗(yàn)(mg/100 mL)Tab.4 Comparative test between biosensor and amino acid analyzer，DBL，HPLC

由以上結(jié)果可以看出，對(duì)于2個(gè)麥芽汁中賴氨酸含量的測(cè)定，生物傳感器法測(cè)定結(jié)果與氨基酸分析儀、高效液相色譜儀及燃料結(jié)合法(DBL)相比較均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。與氨基酸分析儀及DBL法相較而言，SBA-40E法與HPLC法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均較低，說(shuō)明采用生物傳感器法測(cè)定麥芽汁中賴氨酸含量，準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，相較于高效液相色譜的昂貴費(fèi)用，以及復(fù)雜操作，更適用于以麥芽汁為原料的啤酒等實(shí)際生產(chǎn)的定量及實(shí)時(shí)監(jiān)控。

3 討論

麥芽汁中的游離氨基氮(FAN)對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)酵有重要影響，在啤酒發(fā)酵初期，啤酒酵母必須通過(guò)吸收麥芽汁中的含氮化合物合成酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)。不同的氮源組成，不僅對(duì)酵母增殖有顯著的影響，而且對(duì)酵母的代謝、各類風(fēng)味副產(chǎn)物的形成有重要影響，其代謝產(chǎn)物直接決定啤酒的獨(dú)特風(fēng)味［5］。釀造麥芽汁中含有19種氨基酸，賴氨酸作為必需氨基酸，其水平可直接影響啤酒的發(fā)酵，是麥汁中的“標(biāo)志性”氨基酸［6］。

目前，國(guó)內(nèi)外賴氨酸含量測(cè)定主要采用化學(xué)分析法和儀器分析法。化學(xué)分析法主要有染料結(jié)合法(DBL 法，國(guó)標(biāo) GB48014)［7］和茚三酮比色法［8］。DBL法測(cè)定賴氨酸含量的經(jīng)典方法，但需要配套蛋白質(zhì)分析儀或賴氨酸分析儀，這類分析儀器由于使用率低、使用范圍窄、操作易出故障等原因，現(xiàn)在已少有廠家生產(chǎn)。茚三酮比色法(分光光度法)測(cè)定氨基酸簡(jiǎn)便易行，多用于學(xué)生實(shí)驗(yàn)課教學(xué)［9］。但使用茚三酮法測(cè)定賴氨酸含量時(shí)，因亮氨酸、異亮氨酸均與賴氨酸有相近的游離氨基，故底物中的亮氨酸、異亮氨酸均嚴(yán)重影響賴氨酸含量測(cè)定的準(zhǔn)確性［10］。

儀器分析法主要有氨基酸分析儀分析法［11］和高效液相色譜法［12-13］。儀器分析法測(cè)定賴氨酸含量具有穩(wěn)定性好、精度高等優(yōu)勢(shì)，但是儀器分析操作復(fù)雜、費(fèi)用昂貴，且對(duì)樣品前處理前處理要求高。儀器分析是一項(xiàng)復(fù)雜的分析技術(shù)，受試劑純度、操作環(huán)境、儀器分析條件等各種條件的影響，需要專業(yè)的分析人員進(jìn)行測(cè)定，無(wú)法滿足啤酒生產(chǎn)等大生產(chǎn)的實(shí)時(shí)定量和控制。應(yīng)用賴氨酸生物傳感分析儀，直接測(cè)定麥芽汁中賴氨酸的含量，具有專一性強(qiáng)、檢測(cè)精度高、檢測(cè)速度快、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單、使用成本低、酶膜使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，且其測(cè)定結(jié)果與氨基酸分析儀、高效液相色譜比較，無(wú)顯著差異。

［1］趙文琪.麥汁和啤酒中游離氨基氮的重要性［J］.啤酒科技，2006，3:60-62.ZHAO Wenqi.The importance of free amino nitrogen in wort and beer［J］.Beer Science and Technology，2006，3:60-62.

［2］孫士青，李智紅.酶電極法測(cè)定食品中葡萄糖含量的研究［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，1998，20(2):229-231.SUN Shiqing，LI Zhihong.The determination of glucose content in food by enzyme electrode ［J］.Acta Nutrimenta Sinica，1998，20(2):229-231.

［3］JONES M，PIERCE J S.Absorption of amino acids from worter yeasts［J］.Journal of the Institue of Brewing，1964(70)，4:307-315.

［4］苗桂珍.谷物賴氨酸測(cè)定技術(shù)的研究［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，6:12-16.MIAO Guizhen.Research on lysine determination technique in grain［J］.Liaoning Agricultural Science，2000，6:12-16.

［5］賀立東，牛國(guó)煥，王穎.麥汁中的氨基酸及其檢測(cè)［J］.啤酒科技，2007(6):15-16.HE Lidong，NIU Guodong，WANG Ying.Amino acids and its detection in wort［J］.Beer Science and Technology，2007(6):15-16.

［6］LEKKAS C，STEWART G G，HILL A E，et al.Absorption of amino acids from wort by yeasts［J］.J Inst Brew，2007，113(1):3-8.

［7］肖玲，龔月生.染料結(jié)合法測(cè)定豆粕中有效賴氨酸［J］.飼料工業(yè)，2001，22(4):33-34.XIAO Ling，GONG Yuesheng.Determination of available lysine in soybean meal by fuel combination method［J］.Feed Industry，2001，22(4):33-34

［8］張書(shū)賢.茚三酮比色法檢測(cè)飼料中賴氨酸含量的研究［J］.四川畜牧獸醫(yī)，1995，1:34-35.ZHANG Shuxian.Study on detection of lysine centent in feed by ninhydrin colorimetry method［J］.Sichuan Animal and Veterinary Sciences，1995，1:34-35.

［9］路蘋(píng)，于同泉，王淑英，等.谷物賴氨酸測(cè)定方法的評(píng)價(jià)［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(3):70-76.LU Ping，YU Tongquan，WANG Shuying，et al.A review on determination of lysine in cereal［J］.Journal of Beijing Agricultural College，2005，20(3):70-76

［10］李桂玲，李歡慶，劉叢斌.谷物中賴氨酸含量測(cè)定方法的探析［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27(5):65-68.LI Guiling，LI Huanqing，LIU Congbin.Study on determination of lysine content in cereal［J］.Journal of Henan University of Technology，2006，27(5):65-68.

［11］BLACKBURN S.Amino acid determination methods and techniques［M］.1970，2013-2019.

［12］KROMER J O，SORGENFREI O，KLOPPROGGE K，et al.In-Depth profiling of lysine-Producing corynebacterium glutamicum by combined analysis of the transcriptome，metabolome，and fluxome ［J］.Journal of Bacteriology，2002，186(6):1769-1784.

［13］黃建國(guó)，高學(xué)軍，佟慧麗，等。HPLC測(cè)定飼料源小胎產(chǎn)品中的賴氨酸含量［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2009，2:78-80.HUANG Jianguo，GAO Xuejun，TONG Huili，et al.The determination of lysine content in small peptides products from feed protein source by HPLC［J］.Journal of Dairy Science and Technology，2009，2:78-80.