熒光原位雜交探針應(yīng)用于平衡易位t(1，6)(q42;p23)胚胎植入前診斷的研究＊

李江超，張仁禮，張麗麗，陳金娜，石慶榮，熊 麗，關(guān)新元，王麗京*

(1.廣東藥學(xué)院血管生物研究所，廣東 廣州 510006;2.廣東省人民醫(yī)院生殖中心，廣東 廣州 510030;3.香港大學(xué)臨床腫瘤研究部;4.廣東湛江久和醫(yī)院細(xì)胞遺傳室，廣東 廣州 524094;5.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510515)

染色體相互易位是最常見(jiàn)的染色體結(jié)構(gòu)異常，其發(fā)生率為2%－5%。這類(lèi)染色體異常通常無(wú)遺傳物質(zhì)丟失，攜帶者通常無(wú)異常臨床表型，但其生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過(guò)程中由于分離方式異常，形成不平衡配子，導(dǎo)致反復(fù)自然流產(chǎn)、胎兒發(fā)育畸形、死產(chǎn)等妊娠結(jié)局［1］。

隨著植入前診斷技術(shù)的發(fā)展，對(duì)胚胎單細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，可選擇性的對(duì)優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，降低不良妊娠的發(fā)生率［2］。對(duì)于患者植入前診斷的方法的改進(jìn)如新一代測(cè)序，比較基因組等以及特異性PCR方法獲得了一定的成功［3-5］。熒光原位雜交(FISH)也是植入前診斷的手段之一，與測(cè)序、比較基因組微陣列(arrayCGH)相比，F(xiàn)ISH針對(duì)具體染色體相互易位進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，不僅可以診斷染色體不平衡易位，還可以發(fā)現(xiàn)染色體平衡易位改變［6-9］。

6號(hào)染色體異常在臨床上較為常見(jiàn)，其中與1號(hào)染色體的平衡易位比較多［10］，我們針對(duì)個(gè)體化的t(1;6)(q42;p23)患者異常的區(qū)域進(jìn)行DNA探針設(shè)計(jì)，對(duì)正常人單細(xì)胞卵裂球進(jìn)行檢測(cè)，希望初步實(shí)現(xiàn)個(gè)體化的診斷。這種個(gè)性化的診斷模式和研究的深入，有望隨著醫(yī)療水平的發(fā)展可真正的服務(wù)于臨床。

1 對(duì)象和方法

1.1 材料

1.1.1 患者資料 女42歲，核型正常，其丈夫核型為t(1，6)(q42;p23)易位，曾多次自然流產(chǎn)，后繼發(fā)不孕。正常孕婦，其染色體正常，對(duì)其常規(guī)進(jìn)行促排卵，體外受精3天后，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，其余廢胎用于檢測(cè)所制備的染色體平衡易位探針驗(yàn)證。上述體外研究實(shí)驗(yàn)獲得廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.1.2 試劑及儀器 FITC-dUTP，Texas red-dUTP購(gòu)自美國(guó)GE公司，dNTP購(gòu)自美國(guó)promega公司，Nick標(biāo)記緩沖體系購(gòu)自Life公司，原位雜交儀，封片橡皮膠，Block DNA solution購(gòu)廣州外顯子生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 卵裂球的獲得 由臨床醫(yī)生依據(jù)IVF操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用機(jī)械法從胚胎(8個(gè)細(xì)胞，約第三天)取出1個(gè)細(xì)胞放在0.01N鹽酸中，暴露細(xì)胞核，甲醇:乙酸依據(jù)(3∶1)混合用于固定細(xì)胞，在顯微鏡下放置于玻片上，72℃，烤片30 min，備用。

1.2.2 探針設(shè)計(jì)和制備 依據(jù)G顯帶的核型結(jié)果，判斷患者核型是平衡易位:t(1，6)(q42;p23)，設(shè)計(jì)探針見(jiàn)圖2A，將1q42區(qū)域標(biāo)記為紅色(Texas red)(BAC號(hào):RP11-57P24)，6p23標(biāo)記為綠色(FITC)(BAC:RP11-580K19)。結(jié)果判斷:相互易位形成18種配子，正常配子的概率比較低(1/18)，假如是正常配子，那么會(huì)出現(xiàn)兩紅兩綠，共4個(gè)亮點(diǎn)，如果相互易位或其他配子，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)融合信號(hào)。制備FISH探針，如圖所展示，假如出現(xiàn)相互易位，如果信號(hào)融合，則呈現(xiàn)為黃色。我們采用Nick方法標(biāo)記DNA探針，標(biāo)記結(jié)果用2%電泳檢測(cè)，假如標(biāo)記片段的大小在200-600 bp范圍內(nèi)，表明混合片段大小合適。需要指出的是探針的標(biāo)記是整個(gè)斷裂遠(yuǎn)端位置，用來(lái)判斷是否發(fā)生斷裂或融合，不能直接反映配子是否正常。

1.2.3 單細(xì)胞原位雜交 用鉆石筆在玻片上畫(huà)圈，將單細(xì)胞低滲處理后，用固定液(乙酸∶甲醛溶液=3∶1)固定 0.5 h，20 mg/mL 蛋白酶 K 用 PBS稀釋100倍后，滴在單細(xì)胞上，37℃處理5 min，再用4%多聚甲醛固定5 min，梯度酒精脫水，干燥后，滴加探針，儲(chǔ)備探針混合依據(jù):探針1∶探針2∶Block DNA solution∶水 =8∶8∶2∶2，將儲(chǔ)備探針用 DNA 雜交液按照1∶9稀釋，滴加 8 μL，蓋上 20 cm*20 cm 蓋玻片，橡皮膠封片，在雜交儀上共變性5 min在80℃條件下，37℃濕盒過(guò)夜，第二天，72℃條件下用2×SSC/0.1%NP40洗滌3 min，2×SSC洗滌一次。奧林巴斯BX43熒光顯微鏡下拍照。

2 結(jié)果

2.1 患者異常和配偶(作為對(duì)照)的正常染色體核型

患者，男性，常規(guī)外周血染色體G顯帶核型分析診斷為平衡易位:46，XY(1，6)(q42，p23)參考圖1A，其配偶是正常核型圖1B，核型:46，XX。針對(duì)該案例我們進(jìn)行，探針制備和驗(yàn)證，為植入前診斷奠定基礎(chǔ)。

2.2 FISH探針設(shè)計(jì)和制備

我們按照G顯帶的核型結(jié)果，設(shè)計(jì)探針見(jiàn)圖2A，如果正常人核型，那么會(huì)出現(xiàn)兩紅，兩綠共4個(gè)亮點(diǎn)。首先制備FISH探針，我們將1q42區(qū)域標(biāo)記為紅色，6p23標(biāo)記為綠色，如圖所展示，假如出現(xiàn)易位，如果信號(hào)融合，則呈現(xiàn)為黃色。我們采用Nick方法標(biāo)記DNA探針，標(biāo)記結(jié)果2%電泳檢測(cè)如圖3A是標(biāo)記片段的大小(200-600 bp)，說(shuō)明探針混合片段大小合適。

圖1 患者和正常人(配偶)染色體核型Fig.1 The karyotype of Patient and his wife’s karyotype(Normal)

2.3 FISH探針的在正常人和患者中的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證上述制備的平衡易位DNA探針的質(zhì)量和雜交效率，我們?cè)谡Ｈ巳旧w核型和患者染色體核型中進(jìn)行FISH檢測(cè)，結(jié)果如圖所示，所制備的探針，可以檢測(cè)正常人的染色體信號(hào)見(jiàn)圖3A，而在患者的染色體核型中出現(xiàn)融合信號(hào)見(jiàn)圖3B。

2.4 卵裂球單細(xì)胞FISH植入前診斷

圖2 探針設(shè)計(jì)圖示(A)和探針片段驗(yàn)證(B)Fig.2 Probe design and verified by electrophoresis gel

為進(jìn)一步檢測(cè)所制備的探針是否可以應(yīng)用于單細(xì)胞FISH，由于植入前診斷的對(duì)象為卵裂球單細(xì)胞，所以應(yīng)進(jìn)行單細(xì)胞FISH，其單細(xì)胞來(lái)源于輔助生殖中的廢胎(正常人)，檢測(cè)其靈敏度和優(yōu)化FISH條件的實(shí)驗(yàn)條件，我們用分離單細(xì)胞作為檢測(cè)目標(biāo)，其FISH結(jié)果的效果，作為探針可行性與否的依據(jù)，其結(jié)果提示我們制備的FISH探針可以應(yīng)用于單細(xì)胞診斷，而且信號(hào)比較強(qiáng)(曝光時(shí)間:200秒)。我們采用的5個(gè)細(xì)胞中，1，2，3號(hào)為正常核型，可以檢測(cè)到正確信號(hào)，4，5號(hào)細(xì)胞檢測(cè)失敗，結(jié)果代表圖片如圖4，兩紅兩綠，檢測(cè)成功率60%(3/5)。下一步所以我們考慮，有望應(yīng)用于患者的植入前診斷，假如受孕成功，將進(jìn)一步觀察子代的染色體核型。

3 討論

在染色體異常在人群中占一定比例，平衡易位的患者雖然不影響患者的日常生活，但容易導(dǎo)致配偶的流產(chǎn)［11］。由于平衡易位的斷裂位點(diǎn)往往不一樣，每個(gè)患者存的斷裂點(diǎn)特異性大［12-18］，我們針對(duì)平衡易位患者染色體特殊易位位點(diǎn)，制備了個(gè)體化的特異性易位判斷FISH探針，并在正常人和患者的中期染色體核型進(jìn)行驗(yàn)證，使其探針特異性更加準(zhǔn)確有效，進(jìn)行單細(xì)胞診斷，從而實(shí)現(xiàn)了個(gè)體化植入前診斷。

圖3 探針在正常染色體核型和患者染色體和核型上的驗(yàn)證Fig.3 Probe Verification with the normal karyotype and patient karyotype by FISH

圖4 正常卵裂球單細(xì)胞FISH驗(yàn)證探針的可行性Fig.4 Normal blastomere was used to performed single cell FISH with labeled probe

在研究中，我們針對(duì)平衡易位的1q和6p區(qū)域，制備染色體探針，繪制可以檢測(cè)攜帶者的平衡易位染色體探針，進(jìn)一步正常人核型和患者中得確認(rèn)，探針?lè)謩e標(biāo)記兩個(gè)易位片段，一個(gè)片段位于1q，另一個(gè)位于6q。讀取各探針信號(hào)數(shù)目即可知胚胎染色體是否相互易位，在卵裂球單細(xì)胞上原位雜交已經(jīng)引起重視，對(duì)植入前診斷有著重要意義［19-21］。每種探針各出現(xiàn)兩個(gè)信號(hào)時(shí)胚胎染色體組成平衡，染色體未發(fā)生易位。而信號(hào)融合代表平衡易位的染色體的出現(xiàn)，基于上述原理，我們?cè)O(shè)計(jì)，制備，驗(yàn)證，并在單細(xì)胞水平上驗(yàn)證其探針的有效性。不足之處，值得說(shuō)明的是在相互易位的配子中，可能會(huì)出現(xiàn)18種配子，所以檢出率不高，而且依據(jù)我們?cè)O(shè)計(jì)的FISH探針，僅僅是能夠判斷是否發(fā)生斷裂或融合，間接配子是正常，但不能直接排除配子是正常的，所以增加了風(fēng)險(xiǎn)，另外如果細(xì)胞內(nèi)基因的位置恰好彼此較近，將帶來(lái)錯(cuò)誤的判斷，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。但是，目前尚沒(méi)有其他好的技術(shù)來(lái)提高植入前診斷的手段，所以需要投入更多的研究。

本方法中使用商業(yè)化BAC和Nick的方法進(jìn)行探針標(biāo)記，可行性高，重復(fù)性好，但檢出率低，能在正常人和患者同時(shí)驗(yàn)證，提高了探針的特異性。避免了個(gè)體性差異，兼顧了克隆特異性探針的繁瑣過(guò)程，商業(yè)化的探針雖然穩(wěn)定，但不能兼顧個(gè)體性需要，我們從設(shè)計(jì)制備驗(yàn)證在兩周內(nèi)結(jié)束，為了相互易位攜帶者的植入前診斷提供有力的工具，特異性探針的設(shè)計(jì)需要對(duì)斷裂點(diǎn)的準(zhǔn)確判斷，即通過(guò)G顯帶進(jìn)行準(zhǔn)確定位之后而設(shè)計(jì)。本研究設(shè)計(jì)的特異性探針克服了商業(yè)化探針指定位點(diǎn)的局限性，通過(guò)吉姆薩染色后的染色體核型，設(shè)計(jì)針對(duì)特殊病人的探針，可以應(yīng)用于植入前診斷。盡管本實(shí)驗(yàn)，僅僅從該平衡易位的到驗(yàn)證，我們相信針對(duì)每個(gè)特異性染色體易位都可以制備對(duì)應(yīng)的探針進(jìn)行嘗試，從而提高進(jìn)一步的植入前診斷，從而能將這一技術(shù)應(yīng)用于更多攜帶者，將其不利于健康的基因通過(guò)該過(guò)程的篩選，剔除那些易位的染色體。有利于提高人口素質(zhì)，減少疾病和攜帶者的發(fā)生。

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