鼻咽組織熒光壽命影響因素研究＊

陳明惠，李 昊，陳 榮，宋成利*

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，教育部現(xiàn)代微創(chuàng)醫(yī)療器械及技術(shù)工程研究中心，上海 200093;2.醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室(福建師范大學(xué))，福建省光子技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350007)

0 引言

我國的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)患者占全世界鼻咽癌人數(shù)很大比重，且主要集中在南方廣東等幾個省市，包含臺灣［1-2］。熒光光譜與組織癌變的生物化學(xué)特性有很大的關(guān)聯(lián)，因此熒光光譜技術(shù)被廣泛用于腫瘤的診斷。激光誘導(dǎo)熒光發(fā)射包括光譜(頻域)特性和時間(時域)特性兩方面的信息，即穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)(時間分辨)熒光光譜。當(dāng)組織內(nèi)有多種熒光物質(zhì)且各種熒光物質(zhì)之間的熒光發(fā)射光譜相互重疊時，穩(wěn)態(tài)熒光光譜解析不同物質(zhì)組份比較困難，且容易受到激發(fā)光強度、照射距離，組織體大小的影響。而時間分辨熒光光譜從時間馳豫和動力學(xué)角度對熒光物質(zhì)成份進(jìn)行研究，與熒光強度沒有關(guān)系，反映出樣品微環(huán)境物理化學(xué)性質(zhì)和微結(jié)構(gòu)的信息。

熒光壽命(時間分辨熒光光譜)檢測技術(shù)作為癌變組織診斷的一種新方法廣泛用于各種疾病的診斷，包含腎癌、結(jié)腸癌、支氣管癌變、細(xì)菌［3-6］。美國加州大學(xué)的Laura Marcu小組從1999年開始至今一直致力于時間分辨熒光光譜診斷動脈粥樣硬化和腦瘤的研究［7-11］，2011年把時間分辨熒光光譜和穩(wěn)態(tài)熒光光譜結(jié)合應(yīng)用于動脈粥樣硬化診斷，2012年測量血管內(nèi)時間分辨熒光光譜。哈佛醫(yī)學(xué)院2012年［12］采用蒙特卡洛模擬研究人體組織的時間分辨熒光光譜，從組織光子學(xué)的角度分析熒光壽命。2013年Okawa等人［13］研究了老鼠模型的時間分辨熒光光譜成像。

綜上，瞬態(tài)自體熒光光譜作為一種有效的診斷腫瘤的方法，已被廣泛應(yīng)用于人體各種癌變組織，當(dāng)然也應(yīng)用于其他生物檢測方面［14］，但應(yīng)用于檢測鼻咽癌研究工作比較少。本文在測量離體人體鼻咽癌變和正常組織的自體熒光壽命的基礎(chǔ)上，實驗研究了微環(huán)境對熒光壽命的影響因素，得到了不同條件下的熒光壽命，以及各項因素對于熒光壽命的影響程度，解決瞬態(tài)熒光光譜技術(shù)診斷鼻咽癌的關(guān)鍵技術(shù)。

1 實驗方法

實驗測量了68例樣品的自體熒光的瞬態(tài)熒光光譜，其中34例正常鼻咽組織，34例癌變可疑病例，樣品的處理和參考文獻(xiàn)［15-16］一致。實驗儀器是FLS920 Combined TCSPC Spectrofluorimeter and Lifetime Spectrometer System(Edinburgh Analytical Instruments，UK)。該系統(tǒng)是基于皮秒時間相關(guān)單光子計數(shù)，使用高重復(fù)頻率的短脈沖光作為激發(fā)光源，重復(fù)激發(fā)獲得第一個熒光光子到達(dá)的時間概率分布，從而反演出熒光壽命曲線。激發(fā)光源采用納秒氫燈nF900 Node-Hydrogen(EH547DQ，United Kingdom)，超短脈沖半導(dǎo)體激光器波長397 nm(LDH-C-400，PicoQuant GmbH，Germany)和波長為405 nm(EPL-405，PicoQuant GmbH，Germany)。正常組織和癌變組織取自同一位患者，兩者的實驗條件保持一致，并且和穩(wěn)態(tài)測量用同一塊樣品測量數(shù)據(jù)，以便互相驗證。

根據(jù)穩(wěn)態(tài)熒光光譜先得出激發(fā)發(fā)射峰矩陣，實驗測量各個激發(fā)發(fā)射峰位處的瞬態(tài)熒光光譜。從穩(wěn)態(tài)熒光光譜得到人體離體鼻咽正常組織的5個發(fā)射峰，分別是 330、380、460、525 和 600 nm，鼻咽癌變組織只有4個峰，分別是 330、460、525、600 nm。瞬態(tài)熒光光譜采用的光源有納秒氫燈脈沖光源(波長可調(diào)諧)和激發(fā)波長為397、405 nm半導(dǎo)體脈沖激光。納秒氫燈脈沖光為激發(fā)光源，實驗測量了2對，分別是300-330 nm和340-380 nm處的時間分辨熒光光譜;激發(fā)光為激光光源，實驗測量了3對，分別是405-460 nm、397-525 nm和397-600 nm處的時間分辨熒光光譜。

在對樣品測量熒光壽命基礎(chǔ)上，實驗研究了對熒光壽命主要影響因素包含血液、生理鹽水濃度、人體組織的光學(xué)特性參數(shù)、激發(fā)光源的偏振性。

2 實驗結(jié)果

通過測量5對發(fā)射峰處的時間分辨熒光光譜得出的平均熒光壽命如表1所示。330 nm發(fā)射癌變組織的平均熒光壽命大于正常組織。460、525和600 nm發(fā)射處癌變組織比正常組織的平均熒光壽命小。

表1 人體離體鼻咽組織自體熒光發(fā)射峰位的平均熒光壽命Tab.1 Average fluorescence lifetime of human nasopharyngeal tissue in vitroat auto-fluorescence peak positions

圖1所示，采用線性判別式分析人體鼻咽組織在自體熒光發(fā)射峰位330 nm處的平均熒光壽命檢測閾值為3.07 ns，以該閾值作為判別，大于該閾值的為鼻咽癌，小于該閾值的為正常組織，并將此和病理切片診斷的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果相比較，可得到熒光壽命診斷的特異性和靈敏度分別為100%和93.3%，準(zhǔn)確率則為96.15%。同樣對其他發(fā)射峰處的平均熒光壽命作判別，得到各發(fā)射峰處的檢測閾值，如表2所示。結(jié)果表明得出的判別閾值作為診斷，特異性比較高，靈敏度則只有330 nm發(fā)射峰的比較高為93.3%，準(zhǔn)確率比較好的是 330和 525 nm，所以330 nm峰位作為診斷癌變的評價是比較好的。

圖1 人體離體鼻咽癌變和正常組織在330 nm發(fā)射的熒光壽命Fig.1 Fluorescence lifetime for human nasopharyngeal carcinoma and normal tissue in vitro at 330 nm emission wavelength

表2 各個發(fā)射峰的判別閾值和診斷評價Tab.2 Decision threshold and diagnosis evaluation at auto-fluorescence peak positions

人體組織自體熒光壽命除了與其內(nèi)源性熒光物質(zhì)有關(guān)，主要決定于微環(huán)境、細(xì)胞代謝、生理狀態(tài)。實驗研究了血液、生理鹽水濃度、人體組織的光學(xué)特性參數(shù)、激發(fā)光源的偏振性等主要影響因素。

實驗測量了正常與癌變組織分別在保存在不同濃度生理鹽水中的時間分辨熒光光譜，得出兩者的熒光壽命。表3所示為330 nm發(fā)射峰處在不同濃度保存溶液的熒光壽命。無論是正常還是癌變組織在不同濃度的生理鹽水中的熒光壽命相差不大。實驗還研究了其他發(fā)射峰位處的情況，實驗結(jié)果得到，無論是正常組織還是癌變組織，在所有發(fā)射峰位處，在不同濃度生理鹽水的組織的熒光壽命均相差不大。

表3 330 nm發(fā)射鼻咽組織在不同濃度溶液中的熒光壽命Tab.3 Fluorescence lifetime of human nasopharyngeal tissue at different concentration solution at 330 nm emission wavelength

組織的光學(xué)特性參數(shù)是影響組織光學(xué)中光子傳輸?shù)幕灸Ｐ汀１鶅龊蟮慕M織光學(xué)特性參數(shù)發(fā)生了變化，從而其發(fā)射熒光傳輸受到影響，勢必體現(xiàn)在熒光壽命的不同。實驗測量了放置冰箱冷凍層(-18度)一天后的組織的自體熒光時間分辨光譜特性。與直接活檢送檢的樣品對比研究，發(fā)現(xiàn)無論是正常組織還是癌變組織，冰凍一天的壽命與直接送檢的有差異，冰凍一天的壽命更短，如表4所示。其機制是因為冰凍后的組織的散射系數(shù)、各向異性因子和吸收系數(shù)均發(fā)生變化導(dǎo)致其熒光衰減比較快。

表4 在600 nm發(fā)射的冰凍一天與直接送檢的樣品熒光壽命Tab.4 Fluorescence lifetime of frozen sample and un-frozen sample at 600 nm emission wavelength

為了研究激發(fā)光源的性質(zhì)對其自體熒光的時間分辨光譜特性是否有影響，實驗測量了不同的偏振性激發(fā)下的熒光壽命。在對激發(fā)光源不同偏振處理，研究其壽命是否有變化。330 nm處鼻咽癌變在非偏振光和偏振光的平均壽命分別為3.34 ns和3.44 ns。結(jié)果顯示不同偏振處理下激發(fā)光源下的壽命沒有顯著的不同。

3 結(jié)論與討論

本文完成了利用時間分辨自體熒光光譜進(jìn)行人體鼻咽癌組織診斷初步研究。實驗研究了各峰位的時間分辨熒光光譜，分別得出了鼻咽癌變組織和正常組織在330 nm、460 nm、525 nm、600 nm 發(fā)射處的熒光壽命。鼻咽癌變組織在330 nm、460 nm、525 nm、600 nm發(fā)射處的平均熒光壽命分別為3.48±0.27、3.19 ±0.29、2.65 ±0.28、2.94 ±0.51 ns;鼻咽正常組織在330 nm、380 nm、460 nm、525 nm、600 nm 發(fā)射處的平均熒光壽命分別為 2.39 ±0.21、2.36 ±0.37、4.07 ±0.25、3.55 ± 0.60、4.29 ± 0.71 ns。線性判別式分析得到的閾值來診斷得到4個峰位的特異性均為100%，但只有330 nm處的靈敏度和準(zhǔn)確率較高。生理鹽水的濃度對熒光壽命則基本沒有影響。冰凍后的組織的光學(xué)特性參數(shù)發(fā)生變化導(dǎo)致其熒光衰減比較快。不同偏振態(tài)光源激發(fā)下的熒光壽命基本一致。穩(wěn)態(tài)熒光光譜的診斷可利用癌變組織在380 nm處沒有峰位，但是診斷的靈敏度和特異性都有待提高，可以把穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜結(jié)合起來，互相驗證，提高診斷的可靠性，減少漏診、誤診的概率。

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