菟絲子總黃酮對內分泌衰退癡呆模型小鼠學習記憶功能的影響及保護作用機制＊

彭申明，陳 勤*，陳逸青，葉海燕，王 亭

(1.安徽大學生命科學學院，安徽省中藥研究與開發重點實驗室，安徽 合肥 230601;2.德國海德堡大學曼海姆醫學院，德國，曼海姆 68167)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)，又稱老年性癡呆，其主要臨床表現為認知功能障礙［1］，并且其患病率隨年齡增加而升高［2］，在65歲以上人群中約為5%，85歲以上人群中約為20%。目前市場上治療AD西藥主要包括膽堿酯酶抑制劑、改善腦血液循環和腦細胞代謝藥物、鈣離子拮抗劑、自由基清除劑以及雌激素等［3］，但是這些西藥的臨床療效有限或者有一定的副作用［4］。菟絲子是旋花科植物菟絲子(Cuscuta chinensis Lam)的干燥成熟種子。首載于《神農本草經》并列為上品，具有補腎益精，養肝明目，固胎止瀉之功效，是一味著名的補腎中藥。現代研究表明，菟絲子總黃酮(Total flavonoids from semen cuscutae，TFSC)是其主要生物活性成分，藥理研究發現菟絲子或菟絲子黃酮在改善生殖內分泌功能、抗氧化、營養神經、增強免疫力、保護心血管和抗突變等方面均有較好的藥理作用，其中在對生殖內分泌系統的方面作用顯著［5］，有關TFSC是否能改善絕經后女性AD患者學習記憶的報道鮮少，本實驗采用雙側卵巢摘除法制備小鼠內分泌衰退癡呆模型，觀察TFSC對內分泌衰退癡呆小鼠學習記憶能力、血液中雌激素的含量、海馬神經細胞凋亡率以及相關凋亡蛋白表達的影響，并探計其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔健康昆明種雌性小鼠60只，體重25～30 g，購于安徽醫科大學動物實驗中心，合格證書:皖醫動準字號01號。

1.2 藥物與試劑盒

菟絲子總黃酮，安徽省中藥研究與開發重點實驗室制備，經HPLC測定其純度≥95%。戊酸雌二醇片，法國 DELPHARM Lille S.A.S，批號 221A，使用前研磨成粉，蒸餾水配成0.3 mg·kg-1濃度的混懸液;E2放射免疫分析測定盒，北京北方生物技術研究所，批號20120926;

1.3 儀器

GC-911γ放射免疫計數器，中科大科技實業總公司中加光電儀器公司產品;KDC-1044低速臺離心機，中佳科大創新股份有限公司;TGL-16G臺式高速離心機，上海醫用分析儀器廠;HH-W恒溫水浴箱，金壇市恒豐儀器廠;RT-3100全自動洗板機，深圳雷杜公司;Sartorius XP56DR電子天平，德國梅特勒-托利多儀器有限公司;SMG-2型Morris水迷宮自動控制儀裝置(中國醫學科學院藥物研究所);FACSCalibur型流式細胞儀，美國BD公司;DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳儀及DYCZ-40D型迷你轉移槽，北京市六一儀器廠;Fluor Chen E型凝膠成像儀，美國Protein Simple公司。

1.4 內分泌衰退型癡呆小鼠模型的建立［6］

本室改良法:選取50只小鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液(350 mg·kg-1)深度麻醉，俯臥式固定于手術板上，剔除背部毛發，醫用酒精和碘酒消毒背部皮膚，以最后一根肋骨與脊椎中央交叉處為手術切口處，切開此處背部皮膚，再將皮膚輕輕向左側平移，暴露出即將手術區域，小心分離皮下腹膜，在脊椎向左約1 cm處用手術剪剪出約0.5～0.8 cm切口，可見乳白色脂肪，用鈍頭鑷輕輕牽出脂肪，可見其下方有一紅色菜花狀卵巢。在卵巢下方用消毒絲線結扎輸卵管并切除卵巢，縫合切口并消毒;右側摘除卵巢時，將皮膚輕輕向右側平移(免除兩次開刀)，其他方法同上。術后連續3天肌肉注射青霉素粉針(4萬U·d-1)，防止感染。術后第3 d進行分組。將小鼠隨機分成5組，即去勢模型組，雌激素組(0.3 mg·kg-1)，菟絲子低、中、高(35，70，140 mg·kg-1)劑量組，每組10只。假手術組10只小鼠，同上法，但僅切開皮膚與腹膜，暴露卵巢，隨即進行消毒和縫合。造模3 d后開始灌胃給藥，連續灌胃3個月，其中正常組和模型組均給予等體積的0.9%生理鹽水。

1.5 石蠟制片與HE染色

造模結束后，用10%水合氯醛將小鼠深度麻醉后固定在操作臺上，打開顱腔，取出大腦。將小鼠大腦一分為二成兩個半腦，一部分用于流式細胞儀和免疫蛋白印跡，另一部分放置于10%的中性福爾馬林固定，用來做石蠟制片。石蠟制片:取材→固定→流水沖洗過夜→70%乙醇2.0 h→80%乙醇1.5 h→90%乙醇1.0 h→95%乙醇1.0 h→100%乙醇 1.0 h→無水乙醇:二甲苯 =1∶1，30 min→二甲苯(I)20 min→二甲苯(II)20 min→浸蠟(I)1.5 h→浸蠟(II)1.5 h→包埋→4 μm厚度冠狀切片。HE染色:二甲苯(I)12 min→二甲苯(II)12 min→100%乙醇(I)3 min→100%乙醇(II)3 min→95%乙醇(I)3 min→95%乙醇(II)3 min→90%乙醇3 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→自來水洗10 min→蘇木素10-15 min→自來水洗10-20 min→1%伊紅3-5 min→95%乙醇分化30 s→95%乙醇(I)1 min→95%乙醇(II)1 min→100%乙醇(I)1 min→100%乙醇(II)1 min→二甲苯(I)1 min→二甲苯(II)1 min→中性樹膠封片→鏡檢。

1.6 Morris水迷宮行為學測試

Morris水迷宮分為控制系統(電腦軟件)和檢測系統。檢測系統為直徑120 cm水池，分為四個象限，將直徑為15 cm無色透明平臺置于第四象限中央位置，高度低于水面2 cm左右，池水溫度保持在25℃左右。6組小鼠于連續灌胃三個月后進行水迷宮實驗，包括(1)定位航行測試:連續訓練6 d，每天兩次，依次從四個象限將小鼠頭朝池壁入水，記錄每只小鼠的逃逸潛伏期及游泳路程，若60 s后仍找不到平臺，以60 s計算;(2)空間探索測試:訓練的第7 d開始進行空間探索實驗，撤去平臺，以第二象限為入水點，觀察各組小鼠在60 s內穿越平臺的次數。

1.7 小鼠血液中E2的測定

試驗當日15時左右采用眼眶取血法，取血約1 mL，室溫自然凝固或4℃冰箱放置30～60 min，3000 r.min-1離心 10 min，取血清置于 0.5 mL EP 管中，－80℃冰箱凍存。檢測時，從－80℃冰箱取出標本，室溫下靜置1～2 h，待標本完全溶解后，用E2放射免疫分析測定盒檢測E2。

1.8 流式細胞儀檢測海馬神經細胞凋亡率

Morris水迷宮測試結束后，經10%水合氯醛深度麻醉，斷頭后于冰上開顱取腦，置于冷PBS液中清洗去除殘余的血并縱向切開成兩個半腦，取其中一半腦迅速剝離出海馬，用眼科剪剪成小碎塊，加入3 mL PBS液，同時用吸管慢慢吹打，經過200目篩網過濾轉入15 mL離心管中，2000 r·min-1離心5 min，取上清，再次 800 r·min-1離心 10 min，棄上清，加入PBS液2 mL搖勻。將上述制備好的單細胞懸浮液調整濃度為1×106mL-1。取1 mL細胞懸液置于300 μL Binding Buffer液中，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL Propidium Iodide，輕輕混勻，室溫避光反應 10～15 min，在1 h內進行流式細胞儀上機檢測細胞凋亡情況。

1.9 免疫印跡法檢測海馬細胞凋亡相關蛋白的表達

水迷宮測試后，如1.7項下操作，迅速剖取各組小鼠海馬組織。稱取海馬組織0.2 g，并用眼科剪于EP管中剪碎，加入0.5 mL WIP組織裂解液(WIP∶PMSF=100∶1，現用現配)，低溫研磨裂解 30 min，4 ℃ 12000 r·min-1離心 15 min，吸取上清液，應用BCA法進行蛋白含量測定。以PBS調各組蛋白濃度到一致，加入等體積的2×上樣緩沖液混勻，沸水中煮沸5 min變性，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，其中每個泳道蛋白上樣量為20～50 μg，電泳后將凝膠中的蛋白電轉至NC膜上;再將NC膜放入5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫封閉4 h，TBST緩沖液漂洗片刻，將NC膜浸入TBST緩沖液稀釋的一抗溶液［Bax(1∶400)、Bcl-2(1∶300)、Cyt-c(1∶300)、Caspase-3(1∶300)及 β-actin(1∶1000)］，4℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗3×10 min，轉入HRP標記的山羊抗兔IgG溶液(1∶2000)中，室溫孵育1.5 h，TBST緩沖液漂洗3×10 min，TBS漂洗10 min，采用化學發光顯色，凝膠成像分析儀掃描結果，測定各條帶灰度值，以β-actin作為內參，目的蛋白相對表達量為目的條帶與內參的灰度比值。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型小鼠大腦神經細胞病理形態的影響

HE染色顯示:假手術組小鼠海馬CA1區細胞排列緊密整齊，神經元呈圓形或者錐形，核漿比值較大，細胞核為圓形，錐體細胞形態特征明顯，軸突長而有規則，細胞膜清晰;模型組小鼠海馬CA1區錐體細胞排列雜亂間有明顯裂縫，神經元胞體縮小，胞漿空泡變大，神經元數量明顯減少;雌激素組小鼠海馬CA1區錐體細胞排列整齊而緊湊，軸突長而有規律，胞漿空泡較模型組明顯變少，神經元數量增加。經連續用藥3個月，與模型組相比，TFSC三個劑量組小鼠腦CA1區錐體細胞形態均有所好轉，主要表現為錐體細胞排列有序，且海馬區神經元的數量明顯增多，空泡也大為減少，其中以中、高劑量組效果更佳。見圖1。

2.2 菟絲子總黃酮對去勢小鼠血液中雌激素含量水平的變化

從表1可知，與假手術組相比，模型組小鼠血液中雌激素含量顯著下降，差異具有統計學意義(P＜0.01);經灌胃給藥3個月后，與模型組相比，雌激素組小鼠雌激素水平上升差異極顯著(P＜0.01)，TFSC各劑量組血液中雌激素水平明顯增加，且TFSC的劑量呈一定的量效關系，差異具有統計學意義(P＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.01)。

表1 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型癡呆小鼠血清雌激素水平的影響(，n=10)Tab.1 Effects of TFSC on the levels of serum estrogen in Alzheimer’s disease mice’s serum with hypoendocrinism(，n=10)

表1 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型癡呆小鼠血清雌激素水平的影響(，n=10)Tab.1 Effects of TFSC on the levels of serum estrogen in Alzheimer’s disease mice’s serum with hypoendocrinism(，n=10)

與假手術組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組相比#P＜0.05，##P ＜0.01Compared with sham operation group，*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜0.01;Compared with model group，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別Group劑量(mg.kg-1)Dose E2(pmol·L-1)Estradiol假手術組Sham operation group － 48.07 ±7.16##模型組Model group － 10.33±2.53 ＊＊雌激素組Estrogen group 0.3 37.57 ±5.15##TFSC低劑量組TFSC Low-dose group 35.0 14.93 ±4.85#TFSC中劑量組TFSC Middle-dose group 70.0 18.64 ±4.66##TFSC高劑量組TFSC High-dose group 140.0 27.53 ±5.78##

圖1 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型癡呆小鼠海馬神經元病理形態的影響(HE染色×400)(，n=10)Fig.1 Effects of TFSC on neuronal pathological morphology in hippocampus of Alzheimer’s disease mice with hypoendocrinism(HE stain×400)(，n=10)

2.3 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型癡呆小鼠行為學變化的影響

表2和圖2的結果顯示，與假手術組相比，模型組小鼠逃逸潛伏期和游泳路程顯著增加，穿越平臺次數明顯減少，差異極顯著(P＜0.01);連續灌胃給藥3個月后，與模型組相比，雌激素組小鼠逃逸潛伏期和游泳路程明顯減少，穿越平臺次數顯著增加(P＜0.01)，TFSC各劑量組小鼠逃逸潛伏期和游泳路程大大降低，穿越平臺次數增加明顯，差異具有統計學意義(P ＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.01)，提示雌激素組和TFSC各劑量組均可提高內分泌衰退癡呆小鼠的學習記憶能力。

2.4 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型癡呆小鼠海馬神經細胞凋亡率的影響

由流式細胞儀散點圖3可知，假手術組海馬神經細胞的凋亡率為11.73%，模型組海馬神經細胞凋亡率為75.68%，雌激素組海馬神經細胞的凋亡率為29.73% ，TFSC 各劑量組(35 mg.kg-1，70 mg.kg-1，140 mg.kg-1)的海馬神經細胞凋亡率分別為67.94% ，58.39% ，40.16% 。與假手術組相比較，模型組海馬神經細胞凋亡率上升84.50%;與模型組相比，雌激素組和TFSC各劑量組海馬神經細胞凋亡率顯著下降，分別為 60.72%，10.23%，22.85% 和46.93%。這表明雌激素和TFSC可明顯降低內分泌衰退引起的海馬神經細胞凋亡率。

2.5 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型小鼠海馬神經細胞 Bax、Bcl-2、Cyt-c及 Caspase3蛋白表達的影響

與正常對照組相比，模型組海馬區神經元中Bax，Cyt-c和Caspase-3蛋白表達量均明顯升高，Bcl-2蛋白表達量降低顯著，差異具有統計學意義(P＜0.05);連續灌胃給藥3個月后，雌激素組和TFSC3個劑量組均能下調海馬區Bax，Cyt-c和Caspase-3蛋白表達水平，上調了Bcl-2蛋白的表達水平，與模型組相比，差異極顯著(P ＜0.05，P ＜0.05，P ＜0.01)。見圖4。

3 討論

雌激素是女性卵巢分泌的主要激素，在女性乳房、子宮、陰道以及大腦等部位有其作用的靶點與特

異性受體。就學習記憶而言，雌激素與大腦海馬區神經元核內雌激素受體結合后通過基因表達生成一些有益神經元生長、發育與存活的特異性蛋白，以保護海馬區神經元細胞［7］。女性絕經后，由于卵巢萎縮退化和功能減退，反饋性引起下丘腦-垂體-性腺等內分泌器官功能的平衡失調，從而造成體內雌激素水平逐漸降低，并引發女性認知功能下降等［8］，可見絕經后雌激素水平隨增齡性下降是女性AD患病率增高的重要原因之一［9-11］。目前采用雌激素替代療法可以明顯改善和預防絕經婦女癡呆的發生與發展，但是長期服用雌激素可增加AD患者的腫瘤發生［12］。文獻報道［13］菟絲子總黃酮能夠調控下丘腦-垂 體-性 腺 軸 (Hypothalamic pituitary gonadal axis，HPG)的功能紊亂，有效地增加腺垂體對促黃體素釋放素(Lutein releasing hormone，LRH)的反應性，降低促黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)水平，刺激絕經后女性體內分泌雄烯二酮，再經顆粒細胞在卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)中芳香化酶刺激下轉化為雌二醇，進而使體內雌二醇水平顯著上升。本實驗發現，連續口服TFSC三個月后，TFSC各劑量組小鼠體內雌激素水平顯著升高，推測TFSC可能有效促進或調節其下丘腦-垂體-性腺軸的功能，使機體的內分泌功能減退得到一定程度的改善。

表2 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型癡呆小鼠Morris實驗逃逸潛伏期、游泳路程及穿越平臺次數的影響(，n=10)Tab.2 Effects of TFSC on escape latency、swimming distance and the times of across platform of Alzheimer’s disease mice with hypoendocrinism in morris water maze test(，n=10)

表2 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型癡呆小鼠Morris實驗逃逸潛伏期、游泳路程及穿越平臺次數的影響(，n=10)Tab.2 Effects of TFSC on escape latency、swimming distance and the times of across platform of Alzheimer’s disease mice with hypoendocrinism in morris water maze test(，n=10)

與假手術組比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比#P ＜0.05，##P ＜0.01Compared with sham operation group，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;Compared with model group，#P ＜0.05，##P ＜0.01

圖2 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型癡呆小鼠學習記憶能力的影響(，n=10)Fig.2 Effects of TFSC on learning-memory ability in Alzheimer’s disease mice with hypoendocrinism(，n=10)

圖3 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型癡呆小鼠海馬區神經細胞凋亡率的影響(，n=5)Fig.3 Effects of TFSC on neuronal apoptosis in hippocampus of Alzheimer’s disease mice with hypoendocrinism(，n=5)

圖4 菟絲子總黃酮對內分泌衰退型癡呆小鼠海馬區神經元Bax、Bcl-2、Cyt-c和Caspase-3蛋白表達的影響(±s，n=5)。與假手術組比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比#P ＜0.05，##P ＜0.01Fig.4 Effects of TFSC on the expression of Bax、Bcl-2、Cyt-c and Caspase-3 protein from Alzheimer’s disease mice’s hippocampus with hypoendocrinism(，n=5).Compared with sham operation group，

AD患者在臨床上以學習記憶障礙為主要表現，Calissano P等研究發現［14］，AD患者的學習記憶功能障礙與其海馬區神經元細胞大量丟失息息相關。女性絕經前，體內雌激素水平較高，雌激素可以通過與HPG軸上與學習記憶有關大腦區域的雌激素受體結合，提升細胞內神經生長因子(Nerve growth factor，NGF)的表達水平，進而誘導海馬CA1區神經元形成新的突觸，提高突觸的適應性和神經元的生長［15］。絕經后女性體內雌激素水平大幅度下降，失去了雌激素對神經元的營養和保護作用，誘發海馬區神經元細胞經線粒體途徑致細胞凋亡［16，17］。本實驗通過流式細胞儀和蛋白免疫印跡法檢測，證明雌激素組和TFSC各劑量組能顯著升高癡呆小鼠的E2水平，抑制海馬區神經細胞凋亡率，可使抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達顯著提升，同時也明顯抑制癡呆小鼠促凋亡蛋白 Bax、caspase3的表達，減少Cyt-c的表達，顯示雌激素和TFSC具有良好的抑制神經細胞凋亡的作用。Morris水迷宮結果顯示，E2和TFSC具有顯著改善小鼠學習記憶能力，結合TFSC具有提升雌激素水平和抑制細胞凋亡的作用來分析，我們認為雌激素和內分泌功能的正常與否，直接影響到神經元的可塑性、營養環境和存活率，間接地影響AD小鼠的學習記能力，這與臨床上絕經后婦女易患老年性癡呆的現象有相似之處。我們推測，TFSC的作用機制可能與促進或增強下丘腦-腦垂體-性腺軸功能，增加雌激素水平和改善內分泌系統功能有關。有關具有的作用機制，尚需進一步通過分子細胞水平上的驗證與探討。

［1］BALLARD C，GAUTHIER，CORBETT A，et al.Alzheimer’s Disease［J］.Lancet，2011，377(9770):1019-1031.

［2］PEICH M C，HUSAIN M，BAYS P M.Age-related decline of Precision and Binding in visual working memory［J］.Psychology and Aging，2013，28(3):729-743.

［3］STONE J G，CASADESUS G，GUSTAW-ROTHENBERG K，et al.Frontiers in alzheimer’s disease therapeutics［J］.Chronic Disease，2011，2(1):9-23.

［4］HENDERSON V W.Hormone therapy and the risk of stroke:perspectives 10 years after the women’s health initiative trials［J］.Climacteric，2012，15(3):229-234.

［5］柯江維，王建紅，趙宏.菟絲子黃酮對心理應激雌性大鼠海馬-下丘腦-垂體-卵巢軸性激素受體的影響［J］.中草藥，2006，37(1):90-92.KE Jiangwei，WANG Jianhong，ZHAO Hong.Effects of Flavonoids from semen cuscutae on estrogen receptor in hippocampus-hypothalamus-pituitary-ovary axis of female rats exposed to psychological［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，2006，37(1):90-92.

［6］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.(第三版)北京:人民衛生出版社，2002，1537.XU Shuyun，BIAN Rilian，CHEN Xiu.Pharmacological experimental methodology［M］.(3rd edition)Beijing:People’s Health Publishing House，2002，1537.

［7］SARVARI M，KALLO L，HRABOVSZKY E，et al.Ovariectomy and subsequent treatment with estrogen receptor agonists tune the innate immune system of the hippocampus in middle-aged Female Rats［J］.Public Library of Science，2014，9(2):e88540.

［8］QU N，WANG L，LIU Z C，et al.Oestrogen receptor α agonist improved long-term ovariectomy-induced spatial cognition deficit in young rats［J］.The International Journal of Neuropsychopharmacology，2013，16(5):1071-1082.

［9］WANG X P，DING H L.Alzheimer’s disease:epidemiology，genetics and beyond［J］.Neuroscience Bulletin，2008，24(2):105-109.

［10］JAMSHED N，OZAIR F F，AGGARWAL P，et al.Alzheimer disease in post-menopausal women:intervene in the critical window period［J］.Journal of Mid-Life Health，2014，5(1):38-40.

［11］PETROVSKA S，DEJANOVA B，JURISIC V.Estrogens:mechanisms of neuroprotective effects［J］.Journal of Physiology and Biochemistry，2012，68(3):455-460.

［12］SUBA Z.Triple-negative breast cancer risk in women is defined by the defect of estrogen signaling:preventive and therapeutic implications［J］.OncoTargets and Therapy，2014，7:147-64.

［13］K E J，DUAN R.Effects of flavonoids from semen cuscutae on the hippocampal-hypothalamic-pituitary-ovarian sex hormone receptors in female rats exposed to psychological stress［J］.Clinical and Experimental Obstetrics＆Gynecology，2013，40(2):271-274.

［14］CALISSANO P，MATRONE C，AMADORO G.Apoptosis and in vitri alzheimer disease neuronal models［J］.Communicative Integrative Biology，2009，2(2):163-169.

［15］黃月，許予明，張杰文，等.雌激素對AD模型大鼠腦內PTau、ChAT和神經生長因子蛋白表達的影響［J］.南方醫科大學學報，2010，30(10):2408-2410.HUANG Yue，XU Yuming，ZHANG Jiewen，et al.Effects of Estrogen on P-Tau，ChAT and nerve growth factor protein expressions in the brain tissue of rats with Alzheimer’s disease［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2010，30(10):2408-2410.

［16］GRIMM A，LIM Y A，MENSAH-NYAGAN A G，et al.Alzheimer’s disease，estrogen and mitochondria:an ambiguous relationship［J］. MolecularNeurobiology，2012， 46(1):151-160.

［17］SIMPKINS J W，YI K D，YANG S H，et al.Mitochondrial mechanisms of estrogen neuroprotection［J］.Brain Research Reviews，2010，1800(10):1113-1120.