法夫酵母JMU-MVP14菌體中類胡蘿卜素成分分析＊

李慧翔，伍 菱，2，3，4，黃高凌，2，3，4，楊遠帆，2，3，4，肖安風，2，3，4，杜希萍，2，3，4﹡

(1.集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021;3.福建省高校食品微生物與酶工程技術研究中心，福建 廈門 361021;4.廈門市食品與生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021)

蝦青素(3，3'-二羥基-β，β'-胡蘿卜素-4，4'-二酮)是一種極具開發潛力的功能色素，屬于類胡蘿卜素中的一種。大量的體外實驗、動物實驗、以及臨床實驗證明蝦青素具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗癌、提高機體免疫等功效［1-6］。在食品、醫藥、化妝品、水產養殖、畜禽養殖等行業有廣泛的應用前景。

法夫酵母最早由Herman Phaff于1972年從日本和阿拉斯加闊葉樹流出物中分離得到［7］，因其顯著的蝦青素合成能力而受到廣泛的關注。自法夫酵母發現至今，為了使法夫酵母生產蝦青素變為可能，國內外的學者做了大量的研究，包括蝦青素高產菌株的選育［8］，發酵條件的優化［9，10］，提取 條件的 優化［11-13］。其中蝦青素高產菌株的選育多采用突變育種［14，15］，改變法夫酵母的代謝途徑，以期望獲得蝦青素的高產菌株。在已獲得的蝦青素高產菌株中，由于代謝途徑的改變，必然引起菌株中類胡蘿卜素種類與含量的改變。比較突變前后菌株中的類胡蘿卜素種類，可能會有一些新的類胡蘿卜素在突變后的菌株中被檢測到，也有一些類胡蘿卜素從突變后的菌株中消失［16，17］。法夫酵母 JMU-MVP14 菌株為本實驗室由出發菌株法夫酵母 Pst-1通過一系列突變選育得到的一株蝦青素高產菌株。前期研究表明，法夫酵母 JMU-MVP14菌體中總類胡蘿卜素體積產率、蝦青素體積產率、總類胡蘿卜素細胞產率、蝦青素細胞產率分別是 28.45 mg/L、16.53 mg/L、10.38 mg/g及6.01 mg/g，其中蝦青素只占到總類胡蘿卜素含量的57%，多達43%的其他類胡蘿卜素成分是不明確的［18］。本文結合薄層色譜、柱色譜、以及高效液相色譜對法夫酵母JMU-MVP14菌體中類胡蘿卜素成分進行研究，以期獲得單一的類胡蘿卜素成分，以便此后進一步通過波譜技術對其進行定性;同時進一步了解法夫酵母JMU-MVP14菌株的代謝途徑，為后續對該菌株進行基因改造提高蝦青素產量提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實驗材料

法夫酵母菌體，由集美大學生物工程學院發酵研究室選育菌種法夫酵母JMU-MVP14發酵得到;甲醇、丙酮，乙酸乙酯，氫氧化鈉、濃鹽酸均為國產分析純試劑;色譜純甲醇，購自美國Tedia公司;石油醚為國產工業純試劑重蒸餾得到;石英砂、氧化鎂、硅藻土均為國藥集團化學試劑有限公司分析純試劑;200-300目硅膠、薄層層析硅膠板GF254(青島譜科分離材料有限公司);各種規格玻璃色譜柱(定制)。

1.1.2 實驗儀器

安捷倫1200高效液相色譜儀，CARY50型紫外-可見全波長掃描儀，METTLER TOLEDO pH計，LXJIIB離心機，BS233S電子天平，BC/BD-318A型海爾冰柜，RE-52AA型旋轉蒸發儀，SHZ-Ⅲ D型循環水真空泵。

1.2 方法

1.2.1 總類胡蘿卜素的提取

稱量一定量的法夫酵母菌體，按以下流程進行提取。具體操作如下:將市售濃鹽酸(12 mol/L)用蒸餾水稀釋四倍配成3 mol/L的鹽酸，按料液比1∶5(w/v)于室溫、避光條件下對法夫酵母菌體進行破壁30 min。4500 r/min離心5 min，棄去上層酸液，下層菌體用蒸餾水制成菌懸液。用氫氧化鈉將菌懸液中和到pH 7.0，離心棄去上清液，菌體用蒸餾水洗滌三次以脫除中和產生的鹽。先用丙酮對水洗后的菌體提取2次，料液比為 1∶15(w/v)，4500 r/min離心5 min，取上清液。菌體殘渣依次用乙酸乙酯、石油醚分別提取兩次，取上清液。合并丙酮、乙酸乙酯、石油醚三部分的上清液，減壓蒸發濃縮除去有機溶劑，得到法夫酵母JMU-MVP14菌體總類胡蘿卜素提取物浸膏，－20℃低溫保存，以備后續研究。

1.2.2 總提取物全波長掃描

取少量總類胡蘿卜素提取物浸膏用適量的氯仿完全溶解，用等量的甲醇稀釋。以氯仿/甲醇(1∶1)混合溶劑做空白，置于1 cm的玻璃池中，用紫外-可見分光光度計在190-800 nm范圍進行全波長掃描，樣品的濃度調節到最大吸收波長下的吸光值在0.1-1.5范圍內為宜。

1.2.3 類胡蘿卜素的柱層析分離

由于法夫酵母JMU-MVP14菌體中的類胡蘿卜素成分比較多，且同種類胡蘿卜素還有多種順反異構體，加大了分離的難度，在分離純化的過程中要選擇多種固定相相結合的辦法才能達到有效的分離，因此先用硅膠柱對法夫酵母JMU-MVP14菌體中總類胡蘿卜素提取物進行硅膠柱粗分段，再用氧化鎂柱對各組分細分。

1.2.3.1 硅膠柱粗分段 稱量100 g 200-300目的硅膠，110℃烘箱活化2 h，冷卻后用石油醚濕法裝填一根規格為40×200 mm的玻璃柱，硅膠自然沉降后用石油醚平衡至柱床體積不再變化為止。總類胡蘿卜素提取物浸膏以盡可能少的石油醚溶解，濕法上樣，待樣品都吸附到色譜柱上端的固定相中，以石油醚/丙酮梯度洗脫，按色帶收集洗脫組分。洗脫組分真空濃縮至干，－20℃低溫保存備用。

1.2.3.2 氧化鎂柱層析 硅膠分段得到的各組分再經氧化鎂柱進一步分離，柱子規格視樣品質量而定。裝柱操作如下［19］:氧化鎂與硅藻土按質量比1∶1混合，110℃烘箱活化2 h。冷卻后將填料均勻地裝入空柱管，待裝填到所需要的高度后，用真空泵從柱子底端抽真空，將填料壓實，并確保柱上表面填料平整。以石油醚在一定壓力下平衡柱子，直至柱子下端流出液連續，沒有氣泡為止。樣品溶解后濕法上樣，以石油醚/丙酮梯度洗脫。洗脫組分真空濃縮至干，－20℃低溫保存備用。

1.2.4 硅膠薄層色譜分析各組分中的類胡蘿卜素成分

以氯仿溶解樣品，用硅膠G薄層層析板對分離得到的各組分進行薄層色譜分析。展開劑為石油醚/丙酮、石油醚/乙酸乙酯和氯仿/甲醇三個體系。

1.2.5 總類胡蘿卜素提取物浸膏以及柱層析組分的HPLC分析

總類胡蘿卜素提取物浸膏以及柱層析所得到的各組分用氯仿溶解后以等體積的甲醇稀釋，0.22 μm的有機膜過濾，用HPLC分析。色譜條件如下:色譜柱為 Nova-Pak 3.9×150 mm C18柱，4 μm 粒徑;35℃柱溫;475 nm檢測波長(檢測波長選擇為1.2.2中紫外分光光度計全波長掃描得到的最大吸收波長);流動相為甲醇-水體系，0-40 min甲醇 85%-100%，41-58 min甲醇100%，59-66 min甲醇100%-85%;流速 1 mL/min。

2 結果與分析

2.1 總類胡蘿卜素提取物的紫外-可見吸收光譜

法夫酵母JMU-MVP14菌體中總類胡蘿卜素提取物的紫外-可見吸收光譜如圖1所示。總提取物在475 nm處有最大吸收，與文獻報道的蝦青素的吸收波長相符。雖然法夫酵母JMU-MVP14菌體中總類胡蘿卜素提取物中還包含其他類胡蘿卜素，但是蝦青素是其中的主要色素，所以總提取物的紫外-可見光譜表現為蝦青素的特征吸收。

圖1 總類胡蘿卜素提取物的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-VIS spectrum of total carotenoids

2.2 總提取物中類胡蘿卜素成分的高效液相分析

利用高效液相色譜法對總提取物中的類胡蘿卜素做初步分析，結果如圖2所示。在475 nm檢測波長下，總提取物中總共檢測到7個主要的峰。通過在線DAD檢測器獲取這7個峰的紫外-可見光譜圖，他們都在400-500 nm顯示最大吸收，根據文獻報道［20］，可以初步斷定這7個峰都是類胡蘿卜素成分。

由于高效液相色譜進樣量少，樣品濃度低，在總提取物中部分類胡蘿卜素會因為含量低于檢測限而不能被檢測到。此外，沒有一種液相方法可以做到將所有的類胡蘿卜素完全分離，極性相近的兩種類胡蘿卜素會因為不能被完全分離，其中含量較少的類胡蘿卜素會被與之極性相近且含量較高的類胡蘿卜素峰掩蓋。以上兩個因素都使得高效液相色譜檢測到的類胡蘿卜素種類少于菌體中實際所含有的種類數。

2.3 法夫酵母JMU-MVP14菌體中類胡蘿卜素成分的分析

2.3.1 硅膠柱層析組分的分析

經過硅膠柱層析，總提取物被分成四個組分，分別命名為A、B、C、D。組分 A、B分別為黃色和紅色油狀物，在石油醚里溶解性好，－20℃低溫過夜底部有白色沉淀，可能為脂質。組分C為紅色粘稠浸膏，在石油醚里溶解性差，易溶于二氯甲烷。組分D為紅色固體，易溶于二氯甲烷。圖3(a)、3(b)分別為組分C、D的硅膠薄層色譜，展開劑為石油醚/丙酮(5∶1)。(組分A、B薄層不形成清晰的類胡蘿卜素斑點，薄層色譜圖未在文中給出)。

圖2 總提取物中類胡蘿卜素成分的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of total carotenoids

圖3 組分C、D的薄層色譜圖Fig.3 TLC of fractions C and D

2.3.2 氧化鎂柱純化組分的色譜及光譜分析

組分A、B、C、D經過氧化鎂柱多次純化總共得到9種類胡蘿卜素，其中組分A中3種，組分B中1種，組分C中1種，組分D中4種，分別命名為A-1、A-2、A-3、B-1、C-1、D-1、D-2、D-3、D-4。9 種類胡蘿卜素的薄層色譜如圖4所示，除C-1外，其余組分在薄層色譜上都顯示單一的類胡蘿卜素斑點。對這9種類胡蘿卜素進行高效液相色譜分析，C-1顯示兩個相連的色譜峰(肩峰)，其余都顯示單一色譜峰，利用在線DAD檢測器獲取各個色譜峰的紫外-可見吸收光譜。9種類胡蘿卜素的色譜以及光譜數據如表1所示，除A-1、A-2、A-3的光譜顯示為典型的三指吸收峰外，其余組分的光譜都顯示為單一的圓峰。據相關文獻報道，法夫酵母的類胡蘿卜素合成途徑中包含有蝦青素、海膽酮、羥基海膽酮、DCD、HDCD等羰基類胡蘿卜素［21，22］。當羰基與骨架多烯鏈共軛，使這些類胡蘿卜素在有機溶劑中的光譜精細結構損失，光譜顯示為一個單獨、較寬的圓峰［23］，因此可以推斷組分 B-1、C-1、D-1、D-2、D-3、D-4 為含羰基的類胡蘿卜素，可能為蝦青素、海膽酮、羥基海膽酮、DCD、HDCD中的一種或幾種。這給依靠光譜對類胡蘿卜素進行定性帶來了困難，可以通過進一步對分離得到的單一類胡蘿卜素組分進行質譜、核磁共振分析輔助定性。

圖4 氧化鎂柱層析所得9種類胡蘿卜素的薄層色譜Fig.4 TLC of the nine carotenoids separated by MgO column chromatography

表1 法夫酵母JMU-MVP14菌體中分離得到的9種類胡蘿卜素的色譜及光譜特征Tab.1 Chromatography and spectrum characteristics ofthe nine carotenoids separated from Phaffia rhodozyma JMU-MVP14

3 討論

法夫酵母JMU-MVP14菌體中的類胡蘿卜素成分眾多，其中有些類胡蘿卜素之間由于結構非常相近，單純依靠高效液相色譜(ODS柱)很難將其分離開來，在高效液相上表現為保留時間一致。此外，可供選擇的商業化類胡蘿卜素標準品少，價格昂貴;不同批次進樣，同一類胡蘿卜素的高效液相色譜保留時間在一定范圍內波動。以上這些因素都給依靠高效液相色譜保留時間對法夫酵母JMU-MVP14菌體中類胡蘿卜素進行定性帶來不便。由于氧化鎂柱對類胡蘿卜素的分離是根據類胡蘿卜素分子中的雙鍵數目以及雙鍵位置的不同進行分離的，與硅膠柱以及ODS柱基于極性進行分離的原理形成補充，通過硅膠柱色譜和氧化鎂柱色譜相結合的方法，可以將法夫酵母JMU-MVP14菌體中的類胡蘿卜素成分很好地分離開來。本文利用高效液相色譜對總提取物中的類胡蘿卜素分析，僅檢測到7種類胡蘿卜素成分。用硅膠柱和氧化鎂柱相結合的方法對總提取物中的類胡蘿卜素分析，得到9種單一的類胡蘿卜素成分，獲得了較好的分離純化效果，便于下一步利用波譜技術對得到的類胡蘿卜素成分進行定性。

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