鼠巨細胞病毒IE-1核酸疫苗和滅活疫苗聯合免疫抗病毒感染的研究＊

吳舒婷，黃超洋，常海艷，張風華，方 芳，李小曼，陳 則

(湖南師范大學生命科學學院，湖南 長沙 410081)

人巨細胞病毒(HCMV)是最常見的β皰疹病毒，能通過多種途徑如胎盤、母乳、唾液、輸血、器官移植(SOT)、造血干細胞移植(HSCT)等引起初次感染。初次感染后，CMV感染進入潛伏期，病毒能周期性地再活化并從粘膜表面脫落。盡管CMV初次感染通常在免疫健全人群中無臨床癥狀，但在極少數病例中可觀察到有癥狀的疾病，如傳染性單核細胞增多癥和脾腫大等。巨細胞病毒在新生兒中的先天性感染、在免疫抑制的成人中病毒的初次感染或再活化感染能引起較高發病率和死亡率［1，2］。

鑒于HCMV引起新生兒等免疫低下人群的嚴重疾病，并且暫無疫苗批準用于臨床，美國醫藥研究所(Institute of medicine)將HCMV疫苗的研發列為最優先(A high priority)項目［3］。目前在臨床試驗中評測的候選疫苗有編碼HCMV不同抗原的亞單位疫苗、DNA疫苗和病毒載體性疫苗，以及減毒活疫苗Twone株。免疫HCMV DNA疫苗能有效誘導細胞免疫應答和體液免疫應答，細胞免疫應答的主要靶抗原有即刻早期1型蛋白(IE-1)和皮層蛋白pp65，而誘導體液免疫應答的抗原主要為包膜糖蛋白gB。含有gB/pp65二價DNA疫苗已經完成臨床Ⅱ期試驗［4］，而gB、pp65和IE-1的三價DNA疫苗完成臨床Ⅰ期試驗［5］，然而DNA疫苗在人體中單獨免疫時免疫原性較弱。近年來，通過不同的抗原運載體系(“異源性的初免-加強”聯合免疫策略)誘導理想的混合型免疫應答已經成為疫苗研發的另一種選擇。研究表明，此策略能增強免疫效果，提高針對特定免疫原的T細胞應答水平，使抗感染的保護效果更好［6，7］。

研究中，我們選用MCMV病毒感染的動物模型研究CMV感染的預防和治療策略［8］。我們將pIE-1 DNA疫苗對小鼠進行初免，再將甲醛滅活的MCMV疫苗加強免疫小鼠，同時為了增強滅活疫苗的效果，還設置了滅活疫苗單獨免疫組和添加MF59佐劑組，期待這種免疫策略能同時誘導MCMV特異性的細胞免疫和體液免疫，在提供小鼠完全保護的同時有效的阻止MCMV在體內復制并清除病毒。

1 材料與方法

1.1 病毒、質粒和小鼠

本實驗所用病毒是 MCMV的Smith株，感染NIH-3T3細胞進行培養擴增病毒，通過細胞擴增得到的MCMV為TC-MCMV。另外，為了增強病毒的毒力，在小鼠體內對MCMV進行傳代，從小鼠的唾液腺中分離得到的MCMV為SG-MCMV。

本實驗所用IE-1 DNA疫苗是將MCMV Smith株的IE-1基因克隆入真核表達載體pcDNA3.1構建而成的重組表達質粒，命名為pIE-1［9］。

本實驗所用的小鼠為6-8周的SPF級雌性BALB/c小鼠，從湖北省預防醫學科學院動物中心引進，在湖南師范大學生命科學學院SPF級動物房飼養。所有的實驗操作嚴格按照中國實驗動物管理法規條例的規定執行。

1.2 滅活疫苗及佐劑的制備

用TC-MCMV制備MCMV滅活疫苗。MCMV感染的致密單層3T3細胞在37℃二氧化碳培養箱里孵育4-5天，當細胞100%病變，收集感染細胞的培養液。7000 r/min，4℃離心20 min去除細胞碎片，得到粗制的TC-MCMV，定量后按1∶4000的比例加入37%的福爾馬林混勻，置4℃冰箱滅活。一周后取100 μL福爾馬林處理過的病毒粗制液感染3T3細胞，細胞孵育7天并沒有出現病變效應，說明處理過的病毒無感染性。失活的病毒通過超速離心的方法濃縮和分離純化［8，10］，得到甲醛滅活巨細胞病毒疫苗，用FI-MCMV表示。腹腔感染BALB/c小鼠，小鼠的脾臟、唾液腺和肺中并沒有檢測到MCMV，噬斑試驗的結果也表明FI-MCMV滅活成功。滅活的全病毒疫苗蛋白含量用Pierce公司生產的BCA試劑盒測定，用小牛血清白蛋白BSA作為標準對照。

本研究中所用的MF59佐劑是水包油乳劑，由5%的角鯊烯、0.5%的 Tween 80和0.5%的 Span85混合溶于高滅的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，占最終配置好的疫苗溶液體積的6%。疫苗和佐劑混合后置4℃振蕩1 h使疫苗和佐劑充分混勻。

1.3 免疫與攻毒

將6-8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成10組，其中一組為不加任何處理的對照組，每組12只。5組小鼠各免疫50 μg pIE-1 DNA疫苗，剩余的五組不免疫。設此免疫的時間點為第0周。免疫采用肌肉注射輔以電脈沖穿孔的方法，將溶于TE的DNA疫苗注射入小鼠股四頭肌。在肌肉注射針孔的兩側插入電擊儀(BTX ECM-830)的兩根電極，相距0.5cm，然后電穿孔(電壓100 V，電擊時間50 ms，電擊正負各三次，間隔1s)免疫1次。初免2周后，分別取一組用pIE-1初免的小鼠和一組沒有處理過的小鼠，用腹腔注射的方法免疫滅活疫苗。滅活疫苗分為兩種劑量，1 μg 或 4 μg，同時為了增強滅活疫苗的效果，每種劑量還設置了滅活疫苗單獨免疫組或添加MF59佐劑組。設此免疫的時間點為第2周。

小鼠體內傳到第19代的SG-MCMV原液經噬斑試驗檢測后，病毒含量約為107.1pfu/mL，在小鼠體內的半數致死量(LD50)約為105PFU。第4周時，我們用3倍LD50 SG-MCMV病毒腹腔感染每組各9只小鼠。攻毒后連續21天觀察并記錄其中6只小鼠的死亡情況與體重丟失情況。

1.4 抗體檢測

第4周時，隨機采集各組4只小鼠血清，用酶聯免疫吸附反應(ELISA)的方法檢測血清中的IgG抗體。具體操作如下:用含10 μg/mL的 FI-MCMV的包被液包被96孔酶標板，置37℃培養箱孵育2 h;加入含1%BSA封閉液過夜;將各小鼠血清進行倍半稀釋后加入已封閉的酶標板中，孵育2 h;添加生物素標記的羊抗鼠IgG二抗，溫育1 h;加入堿性磷酸酶標記的鏈菌蛋白后，溫育1 h;加入pNPP顯色。在酶標儀中測出吸光值為414 nm-405 nm的OD值。以對照組血清的平均值加2倍SD的和作為抗體陽性的本底值，最終確定各抗體最高的稀釋滴度。

1.5 酶聯免疫斑點(ELISPOT)法檢測IFN-γ

第4周時，每組小鼠隨機選取3只，處死并摘取脾臟后用于分離小鼠脾臟淋巴細胞。按照Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit(達科為)的使用說明進行操作，ELISPOT 96孔板中，將分離得到的每只小鼠的淋巴細胞按2×105個細胞/孔加入，同時加入4 μg/孔的MCMV IE-1抗原的 CD8 T細胞表位肽168-YPHFMPTNL-176(H-2d限制型，由上海生工生物技術公司合成)，混勻后置37℃培養20 h，傾倒細胞，加入去離子水使細胞完全裂解。洗去細胞殘片，加入100 μL/孔生物素標記的二抗，37℃溫育1 h;洗板后加入100 μL/孔的酶聯親和素，37℃溫育1 h;洗板后加入100 μL/孔的AEC顯色液，室溫避光靜置15 min，移去顯色液，用去離子水洗正反面及底座，將板置于室溫陰涼處，晾干后送至達科為公司讀數。讀板所得斑點數目用以分析小鼠脾臟細胞分泌IFN-γ的情況，評價小鼠體內細胞免疫水平。

1.6 脾臟和唾液腺的病毒滴度測定

MEM細胞培養液，無菌研磨，磨成勻漿，離心勻漿液，將上清液保存于－80℃冰箱內。用噬斑實驗法檢測脾臟和唾液腺中的病毒滴度。具體操作如下:將器官勻漿液分別進行10倍系列稀釋，每個稀釋度感染培養于24孔板中的NIH-3T3細胞，每只小鼠三個重復，每孔感染體積為 100 μL。5%CO2，37℃孵育1 h后去上清液，每孔加入0.5 mL粘性培養基。5-7天后，每孔細胞中病毒斑的數目，計算出每個樣本的病毒滴度(用Log pfu/mL)表示，每個實驗組病毒滴度用每組小鼠的樣本病毒滴度的平均值±SD值表示。

1.7 統計學分析

實驗數據的評定用的是Student’s t-test軟件;P＜0.05表示差異顯著。小鼠存活率的結果是否有顯著性差異用Fisher’s exact test比較。

2 結果

2.1 攻毒后小鼠的存活率、體征和體重變化

MCMV IE-1 DNA疫苗單獨或者兩周后加強免疫MCMV滅活疫苗，二免后兩周用3倍 LD50的 SGMCMV腹腔途徑感染BALB/c小鼠。其中滅活疫苗分為兩種劑量，1 μg或4 μg，同時為了增強滅活疫苗的效果，分別設置滅活疫苗單獨免疫組和添加MF59佐劑組。在攻毒后21天內觀察小鼠的體征變化并記錄第 0、3、5、7、14、21 天中各免疫組小鼠的體重丟失情況和死亡情況。

如表1所示，未免疫的空白對照組小鼠在攻毒后全部死亡，pIE-1 DNA疫苗單獨免疫組(IE-1組)小鼠的存活率為50%，未添加MF59佐劑的1 μg或4 μg滅活疫苗單獨免疫組(1 μg 組和 4 μg 組)存活率分別為0%或50%。添加了MF59佐劑的滅活疫苗單獨免疫(1 μg/MF59組和4 μg/MF59組)的效果得到增強，小鼠存活率分別為83.3%和100%。采用pIE-1 DNA疫苗和滅活疫苗聯合免疫策略后，加免了未添加MF59佐劑的1 μg或4 μg滅活疫苗單獨免疫組小鼠存活率分別為66.7%或100%(IE-1+1 μg組或 IE-1+4 μg組)，而在聯合免疫策略中添加 MF59 佐劑((IE-1+1 μg/MF59 組或 IE-1+4 μg/MF59組))能使小鼠全保護。

表1 IE-1 DNA疫苗和滅活疫苗聯合免疫小鼠后抗致死量SG-MCMV攻擊的保護力Tab.1 Protection against SG-MCMV challenge in mice co-immunized with IE-1 DNA vaccine and inactivated vaccine

同樣的，在 IE-1 組和 1 μg組、4 μg 組中，小鼠有明顯的聳毛、畏寒、畏光等體征，而在添加了MF59佐劑的滅活疫苗組以及DNA疫苗、滅活疫苗聯合免疫組中，小鼠的體征較輕。特別在IE-1+1 μg/MF59和IE-1+4 μg/MF59組中，小鼠無明顯體征。而在攻毒后21天內小鼠體重丟失情況可見圖1。

2.2 攻毒后小鼠器官的殘余病毒量

用致死劑量SG-MCMV感染小鼠，小鼠的脾臟是病毒侵襲的主要器官，感染后4-5天，脾臟中MCMV滴度達到峰值，隨后下降，直到第9天時檢測不出病毒。無保護的小鼠或保護較低的小鼠脾臟經病毒感染后，出現嚴重的病變。從表1中結果可以看出:在攻毒后5天，對照組小鼠脾臟病毒滴度最高，達到103.90±0.04pfu/mL;各免疫組小鼠脾臟細胞中的病毒滴度與對照組比呈顯著性下降;與滅活疫苗單獨免疫或輔以MF59佐劑的各組相比，采用IE-1和滅活疫苗聯合免疫策略的對應各組中病毒滴度下降或者顯著下降，其中IE-1+4 μg/MF59組病毒滴度最低，與IE-1單獨免疫組相比也有顯著性差異。

圖1 IE-1 DNA疫苗和滅活疫苗聯合免疫的小鼠經致死量SG-MCMV攻擊后的體重丟失率Fig.1 Weight loss rate of mice co-immunized with IE-1 DNA vaccine and inactivated vaccine after lethal dose of SG-MCMV challenge

唾液腺是病毒感染后MCMV潛伏和散播的主要器官，因此，在攻毒后21天檢測唾液腺中病毒滴度能夠很好的衡量疫苗誘導保護性免疫清除體內感染病毒的能力。表1結果表明，除對照組和1 μg組因小鼠全部死亡外，其他各組中均可檢測到病毒;采用聯合免疫策略的各組病毒滴度均低于4 μg組或IE-1組，而與4 μg組相比，輔以佐劑的4 μ/MF59組以及聯合免疫的 IE-1+4 μg 組、IE-1+4 μg/MF59 組均顯著性下降。

2.3 抗體應答

第4周，各組隨機挑選4只小鼠取尾血檢測MCMV特異性IgG抗體水平，結果如圖2所示。結果表明，隨著滅活疫苗劑量的增加，IgG抗體滴度升高，同時MF59佐劑可以增強滅活疫苗誘導的體液應答水平。在聯合免疫組中，IgG抗體與對應的滅活疫苗一次免疫組相比，無顯著性差異，表明“異源初免-加強”聯合免疫策略不會影響抗體的應答水平。

2.4 細胞免疫應答

小鼠經IE-1單獨或聯合滅活疫苗免疫后，用ELISPOT的方法分析各組小鼠體內誘導細胞免疫應答水平。ELISPOT斑點數目反映了IE-1特異性的T細胞應答水平，結果如圖3顯示。經pIE-1 DNA疫苗一次免疫后，均誘導高水平的分泌IFN-γ的脾臟淋巴細胞數目。聯合免疫組與對應的滅活疫苗一次免疫組相比，IE-1特異性的分泌IFN-γ脾臟細胞數目具有顯著性差異，其中IE-1+4 μg/MF59組誘導產生的分泌IFN-γ的脾臟淋巴細胞數目最高，達到了673個斑點/2×105個脾細胞。

圖2 小鼠免疫后血清中MCMV特異性IgG抗體滴度Fig.2 MCMV special IgG antibody titers in sera of mice after vaccination

3 討論

臨床試驗表明對目標人群免疫HCMV疫苗，可有效地減少HCMV發病率和致死率。目前用于臨床前以及臨床試驗研究的HCMV候選疫苗包括DNA疫苗［4］、減毒活疫苗［11］、亞單位蛋白類疫苗［12，13］或重組病毒載體疫苗［14］。臨床Ⅱ期試驗中，gB/pp65二價DNA疫苗免疫血清陽性的器官移植病人后，可誘導顯著數量的pp65特異性T細胞應答，有效地減少了病人體內病毒血癥持續的時間，但是gB和pp65特異性抗體無顯著增加［4］。在另一個臨床Ⅱ期試驗中，gB輔以MF59佐劑免疫血清陰性的孕齡婦女可提供50%的保護，并且可減少她們胎兒的先天性感染率［13］。在之前的研究中，減毒活疫苗Towne株可誘導中和抗體和T細胞應答，但是誘導分泌干擾素-γ(IFN-γ)的特異性 CD4 和 CD8 T 細胞數目不足［11］，以及對減毒活疫苗對免疫低下人群安全性的考慮，限制了Towne疫苗的臨床應用。

圖3 免疫后小鼠脾臟分泌IFN-γ淋巴細胞計數Fig.3 IFN-γ secreting splenocytes in mice after immunization

一種有效的HCMV疫苗應當同時誘導HCMV特異性抗體和T細胞應答，而為了使候選疫苗能完全抗HCMV的感染，候選疫苗中有必要加入多種抗原提高免疫原性。在包括流感病毒和HIV等病毒的疫苗研發中“異源初免-加強”的聯合免疫能很好的誘導和增強病原微生物特異性的體液應答和細胞免疫應答［15-19］，提高針對病原體感染的保護力［6，7］。而將HCMV的抗原基因制備DNA疫苗和減毒活疫苗Towne進行“異源初免-加強”的聯合免疫，證明在動物模型和臨床試驗中有較好的免疫原性［5，20］。鑒于CMV嚴格的種屬特異性，HCMV無法直接感染動物，而MCMV與HCMV有相似的生物學特性，對宿主的器官有相同的嗜性，并可誘導體液和細胞免疫應答，因而用MCMV感染的小鼠為動物模型，研究CMV的致病性和CMV疫苗的保護效果［21］。Morello等人將MCMV gB、M84和IE-1 DNA疫苗混合初免BALB/c小鼠，隨后進行滅活疫苗輔以鋁佐劑加免后，能提供小鼠抗亞致死劑量的MCMV感染［22］。

在本研究中，由于我們制備的滅活完全的MCMV疫苗只是粗略提純，并沒有進行精細的密度梯度離心，滅活疫苗溶液中可能含有IE-1等基因編碼的非結構蛋白，因此在ELISA檢測中用滅活疫苗包被能檢測出針對IE-1的抗體。而ELISPOT分析結果表明添加了MF59的滅活疫苗組也可檢測出IE-1特異性的分泌IFN-γ的T淋巴細胞，表明MF59可增強疫苗誘導的細胞應答。同時，我們的結果表明，“異源初免-加強”聯合免疫中，IE-1初免后誘導的T細胞應答與隨后的滅活疫苗誘導的抗體應答不會相互干擾，證明此聯合免疫的可行性。聯合免疫策略誘導小鼠產生了高達100%的完全保護效果，僅在加強免疫較低劑量的滅活疫苗IE-1+1組中保護效果為66.7%，證明此聯合免疫的有效性。同時，我們的研究也證明“異源初免-加強”聯合免疫策略中，蛋白類疫苗輔以MF59佐劑，可以達到更好的效果。這些結果，可為人用HCMV疫苗的研發提供參考。

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