小鼠LRRC10腺病毒載體構建及其在心肌細胞中的表達＊

周作瓊，彭夕洋，肖麗娜，李佑鋒，彭 浩，吳秀山，范雄偉，李永青

(湖南師范大學蛋白質化學及魚類發育生物學教育部重點實驗室心臟發育研究中心，湖南 長沙 410081)

Lrrc10(Leucine-rich Repeat Containing protein 10)是心臟特異表達因子，它含有7個富含亮氨酸重復基序，這些基序可為蛋白間相互作用提供結構框架［1～2］。目前研究表明，該基序在抑制酶活性、調控細胞生長、細胞黏附、信號轉導、調控基因表達、細胞凋亡信號和發育中發揮重要作用［3］，早期心臟發育重要調控因子 GATA4和 Mef2c［4～7］可結合到Lrrc10啟動子上，非協同性促進Lrrc10的表達［8］。在小鼠中研究發現，Lrrc10在胚胎期7.5天就在心臟中開始表達 ，并在成體中一直持續性高表達，表明該基因很可能參與調控早期心臟發育和維持成體心臟的功能［9］。已有研究發現 ，在斑馬魚中敲低Lrrc10的表達，使心臟出現了環化障礙的表型，提示該基因的表達是斑馬魚心臟發育所必須的［10］。最新研究表明，Lrrc10的基因敲除小鼠在1個月就表現出自發性的擴張型肥厚，與心臟功能受損，暗示著Lrrc10在病理性心肌肥大中的抑制作用。盡管缺失功能的策略發現Lrrc10在維持小鼠正常功能的必要作用，但是Lrrc10的過表達是否能充分的抑制心肌細胞肥大，以及其在成體中調控心肌肥厚的作用機制仍不清楚。鑒定一些組織特異性心肌肥厚抑制因子對于開發低副作用藥物，預防和治療心臟疾病，具有重大應用前景和現實意義。利用腺病毒轉染的方式能夠使外源的基因在原代心肌細胞中高效表達，本文構建了小鼠過表達Lrrc10基因與HA標簽的融合腺病毒，該病毒可以在原代心肌細胞中高效的表達帶有HA標簽的Lrrc10融合蛋白。后續研究Lrrc10在心肌細胞的功能時，HA標簽的存在可為在細胞與組織內檢測和跟蹤Lrrc10蛋白表達和定位提供方便。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 DNA、質粒、細菌和細胞 從小鼠心臟組織中提取mRNA，通過逆轉錄得到小鼠 cDNA。pMD-18T載體購于TAKARA公司。pAd-track-CMV穿梭質粒和BJ5183細菌以及293A細胞由第三軍醫大學惠贈。

1.1.2 主要試劑和耗材 PmeⅠ和 PacⅠ內切酶購自Biolab公司 (New England)。Sal Ι和Hind III限制性內切酶、T4 DNA連接酶、CA2離心柱型膠回收試劑盒等購自賽百盛生物技術有限公司。PCR產物純化試劑盒由北京博大泰克生物基因技術有限責任公司提供。小量快速質粒提取試劑盒來自杭州V2Gene公司。卡那霉素和氨芐青霉素購自上海華舜公司。兔抗鼠HA一抗由美國 Santa Cruz生產。LipofectamineTM 2000由美國Invitrogen公司提供。RPM I 1640培養基和胎牛血清 為美國Hyclone公司產品。

1.2 方法

1.2.1 mLrrc10穿梭質粒的構建 從 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查詢小鼠 Lrrc10(mLrrc10)的cDNA序列，用primer 5軟件設計引物如下:5'-GTCGTCGACTCCCTGACAGAGTT GGTG-3';5'-TCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGAG CTGGAAGGAAG-3'。用PCR擴增出編碼 Lrrc10與HA標簽的融合蛋白的DNA片段。該目的片段大小為900 bp。凝膠回收并與pMD-18T載體連接，測序。將正確片段，用Sal Ι和Hind III酶切，與用相同酶切的pAdtrack2 CMV-IRES-GFP穿梭質粒按照 3∶1(mLrrc10∶pAdtrack-CMV-IRES-GFP)的摩爾比，在16℃條件下，T4連接酶連接過夜。連接產物轉入大腸桿菌中，用卡那霉素篩選出陽性克隆。

1.2.2 重組腺病毒質粒的構建 提取 pAdTrack-CMV2-mLrrc10質粒，以 PmeⅠ酶線性化后，將產物膠回收。轉入 BJ5183感受態細菌，在 BJ5183中同源重組，卡那霉素抗性篩選出陽性克隆。提取質粒，PacⅠ酶切鑒定后，命名為 pAd-mLrrc10。然后轉染大腸桿菌 DH5α，大量制備重組質粒 DNA。以 PacⅠ線性化后，采用純化試劑盒純化，保存于 －20℃備用。

1.2.3 重組質粒在293A細胞中的包裝 、觀察將293A細胞接種于60 cm2培養瓶進行復蘇。當細胞融合率達80%后，將線性化的pAd-mLrrc10凍融三次，取4μg，按 Lipo2fectamineTM的使用說明轉染至293A細胞中。5 h后換液，轉染 7～14 d后于熒光倒置顯微鏡下觀察293A細胞中 GFP(載體自帶GFP)的熒光表達情況。

1.2.4 重組腺的病毒擴增 將293A細胞接種于75 cm2培養瓶進行復蘇。當細胞融合率達90～95%后，使用60 mm培養皿進行轉染:取 200μL重組腺病毒保存液加入到培養液中，大約7天后，很多細胞從培養皿上脫落下來，出現大范圍的CPE(cytopathic effect，細胞病變效應)現象。收集液體，液氮和37℃反復凍融3次。2000 r/min離心10 min。取上清，即為病毒粗提液，－80℃分裝保存。

1.2.5 心肌細胞的分離和培養 剪取小鼠心室部分，置于冰浴的D-Hanks溶液中，擠壓心臟、洗凈血液。然后，使之全部浸沒于1 mL 0.06%胰酶的平皿中，用剪刀剪碎心臟，再加14 mL 0.06%胰酶，4℃消化過夜。第二天，吸出9 mL胰酶，加入9 mL 0.1%的膠原酶II，在磁力攪拌器上攪拌，34℃，100-120 r/min離心30 min。將消化液吸入到10 mL DMEM-F1210%FBS的培養基中，輕微吸打后，1000 r/min離心10 min，再棄上清。細胞沉淀中加入5 mL DMEM-F1210%FBS再洗一次，1000 r/min離心6 min。再棄上清，用20 mL DMEM-F1215%FBS Brdu(Brdu濃度為0.067 mg/mL)洗細胞，用200目篩將細胞液過濾至兩平皿中，10 mL/皿。培養箱培養2 h后，顯微鏡下可見有部分細胞貼壁，將懸浮的細胞和液體吸入到一個50 mL的離心管中，用吸管輕輕吹打細胞團，然后分裝入已鋪好明膠的兩皿中，每皿10 mL;繼續培養24 h，顯微鏡下可見能跳動的心肌細胞，48 h換液。

1.2.6 重組腺病毒的免疫印跡鑒定 用 pAd-mL-rrc10重組病毒子和空載體腺病毒子 Ad(陰性對照)感染心肌細胞，72 h后可見較多綠色熒光，收獲細胞，提取總RNA和蛋白質，10%SDS-PAGE電泳，電轉移至硝酸纖維素膜 (NC膜)上，經5%脫脂牛奶常溫封閉 2 h，10 mmol/L PBS(pH 7.4)洗滌后，兔抗HA一抗體 ，4℃孵育過夜，10 mmol/L PBS(pH 7.4)洗滌后，二抗常溫孵育2 h，化學發光顯色。

2 結果

2.1 pAd-mLrrc10腺病毒載體的構建和鑒定

將測序正確的 pMd-18-T-mLrrc10用 Sal Ι和Hind III酶切后，回收后與pAd-track-CMV連接。經轉化并提取質粒，用Sal Ι和Hind III酶切pAdTrack-CMV-mLrrc10。凝膠電泳后可見2條帶，大的約為9200 bp，小的約為900 bp，證明連接成功(圖1A)。將 pAdTrack-CMV-mLrrc10與 pAdeasy重組后，用PacⅠ酶切可見一約34 kb條帶和一條4 kb條帶，說明 pAd-mLrrc10載體構建成功(圖1B).

圖1 pAd-Track-CMV-mLrrc10和pAd-mLrrc10酶切鑒定圖Fig.1 Identification of plasmid pAd-Track-CMV-mLrrc10 and pAd-mLrrc10 by restriction enzyme digestion

2.2 重組腺病毒的包裝和擴增

pAd-mLrrc10轉染293A細胞后，24 h可見 GFP表達，此后熒光逐漸增多，12 d時可見熒光成片出現(彗星狀 )(圖2)，熒光出現7天后，可見細胞大部分飄起，收集細胞，通過液氮凍融的方法，提取裂解的原代病毒液，將原代病毒液直接感染293A細胞，24 h后仍可見綠色熒光。

圖2 pAd-mLrrc10轉染293A細胞12 d后的熒光顯微鏡觀察結果 (×200)Fig.2 Observation of pAd-mLrrc10 transfected 293A cells after 12 days of transfection with fluorescence microscopy(×200)

2.3 pAd-mLrrc10腺病毒在心肌細胞中的表達

pAd-mLrrc10腺病毒感染心肌細胞，96 h后可見較強的熒光表達。感染后的心肌細胞形態完整，沒有因感染腺病毒而出現死亡的現象(圖3)。

圖3 pAd-mLrrc10腺病毒感染心肌細胞的熒光顯微鏡觀察結果(×200)Fig.3 Observation of pAd-mLrrc10 adenovirus infected cardiomyocyte with fluorescence microscopy(×200)

2.4 免疫印跡鑒定腺病毒介導的Lrrc10在心肌細胞中的表達

為了確定所構建的腺病毒能否介導mLrrc10的表達，將在293A細胞中包裝的病毒粗提液感染分離的原代小鼠心肌細胞。提取總蛋白后，用HA的一抗和羊抗兔二抗檢測。免疫印跡的結果顯示，感染重組Ad-Lrrc10腺病毒的心肌細胞中檢測到Lrrc10的特異性條帶，而感染陰性對照腺病毒Ad-GFP的心肌細胞中未檢測到該條帶(圖4)。

圖4 Western-blot檢測Lrrc10-HA在心肌細胞中表達:adv-gfp:空載體，adv-Lrrc10-HA為pAd-mLrrc10腺病毒載體Fig.4 Analysis of Lrrc10-HA expression in cardiomyocyte with western blot:adv-gfp represents empty vector，adv-Lrrc10-HA represents pAd-mLrrc10 adenovirus vectors

3 討論

目前，由于心臟病死亡的人數逐年增加，而從基因分子生物學的角度去闡述抵御心肌肥大作用機制以及鑒定抵抗心肌肥厚的作用分子一度成為研究的熱點。Lrrc10是在小鼠胚胎早期就開始表達［9］而在心臟中一直維持著特異性高表達的基因，受心臟發育早期重要的轉錄因子GATA4，Mef2c和Nkx2.5等調控。其在心臟發育和成體心臟中的功能一直被人關注。研究發現在斑馬魚中，Lrrc10表達缺失，會導致心臟環化異常，最終引起胚胎死亡［10］。而最新研究又表明，Lrrc10敲除小鼠在出生前會出現心臟收縮功能障礙，特別是出生后會出現擴張型心肌病［11］。由此可見Lrrc10可能對于心臟具有潛在的保護功能，有可能成為良好的基因治療藥物。

腺病毒在研究基因的功能和進行基因治療方面具有重要應用，主要具有以下優點:1、原代心肌細胞利用傳統的脂質體轉染的方法其轉染效率十分低下，不能介導外源基因高效表達，腺病毒介導的過表達系統不受靶細胞是否為分裂細胞所限，且毒性低。此外，研究發現通過尾靜脈注射攜帶著基因過表達腺病毒顆粒，可以成功介導外源性基因，在心臟組織中得到較為特異性充分表達。2、能有效進行增殖，滴度高。3、幾乎不整合到宿主細胞基因組，不引起插入突變。

本研究構建的腺病毒載體，其基本骨架內存在GFP表達序列，這使得克隆的外源基因通過IRES與GFP共表達，這樣被病毒感染的心肌細胞將發出綠色熒光，從而可判定感染的效率。我們用PCR從小鼠cDNA文庫中擴增mLrrc10，測序正確后，使之與pAd-track重組構建含mLrrc10全長編碼序列的穿 梭 質 粒pAd-Track2-CMV2-mLrrc10。該質粒用PmeⅠ線性化后，轉化入含有 pAdeasy的細菌BJ5183。在BJ5183內recA重組酶的作用下，同源重組形成腺病毒質粒。然后在 PacⅠ線性化暴露反向末端重復序列后，轉染293A細胞后，發現293A細胞能發出綠色熒光，說明腺病毒質粒在細胞中已經成功表達。反復凍融收集裂解液后，直接與293A細胞混合，24小時后可見更加強烈綠色熒光，表明重組的腺病毒產生。分別將含mLrrc10的病毒和空的腺病毒感染小鼠心肌細胞，發現心肌細胞中表達出綠色熒光，說明腺病毒成功介導了外源片段在心肌細胞中的表達，免疫印跡檢測顯示在32 kD的位置，檢測到HA標簽的表達，表明心肌細胞 mLrrc10-HA融合成功表達。

目前市場上作用于Lrrc10的多克隆抗體，具有特異性不良穩定性不佳等問題，這對于研究Lrrc10功能極為不利。在本實驗中，我們在Lrrc10基因編碼區后增加了一段HA標簽序列，這樣，用HA的特異性抗體檢測融合蛋白的表達，為準確的檢測Lrrc10的表達水平以及跟蹤Lrrc10蛋白在細胞和組織中的表達位置提供方便。

本實驗構建小鼠Lrrc10腺病毒載體的步驟簡單，載體構建的時間短，而且所得病毒滴度高，足夠滿足體外實驗的要求，同時在大量擴增病毒的基礎上進行純化，所得病毒也能滿足體內實驗。本實驗成功構建了mLrrc10的重組腺病毒載體。為進一步研究病理性心肌肥厚中Lrrc10在心肌細胞中的生物學功能，闡述其分子機制，以及其在基因治療方面的研究，奠定了良好的基礎。

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