產酸丙酸桿菌生長特性及5 L罐發酵動力學研究＊

梁澤鑫，王菊芳

(1.廣東省醫療器械質量監督檢驗所，廣東 廣州 510080;2.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006)

丙酸作為一種精細化工產品和有機合成材料，被廣泛用作食品、谷物、飼料的防腐劑［1-2］，相比于苯甲酸，山梨酸，因為其安全性、經濟性受到了人們的普遍歡迎，并且丙酸及其鹽被美國食品藥品監督管理局認定為GRAS(Generally recognized as safe即一般認為安全)［3］;其衍生物在制藥、塑料、香料、除草劑等行業中也有廣泛的應用［1-3］。

美國和德國是丙酸生產大國，其產量約占全球丙酸總產量的90%以上，這些基本上采用化學合成的方法來生產，2006年全球丙酸需求量為349000噸，2006-2010這五年間，丙酸全球年消費增長率大約為2.5%［4］;在我國，丙酸年產量僅為1000多噸，遠遠不能滿足市場需求，隨著我國經濟騰飛，飼料，食品，醫藥，農藥等行業也飛速發展，對丙酸的需求量越來越大，據相關文獻報道，我國丙酸進口量從1996年6700噸增加到 2004年的1.6萬噸［5］。

目前丙酸的生產主要采用化工合成的方法，但隨著石油資源的日益匱乏及人們對環境保護的重視，微生物發酵法生產丙酸作為一種替代途徑越來越受人們的青睞［6］。相比石油化工法，微生物發酵法生產丙酸具有以下優勢，首先，化學合成法生產丙酸的所需原料丙烷，丙醛等的價格易受當今石油產量和價格的波動而波動，原料供應不暢容易造成丙酸市場的不穩定;其次，通過發酵法制得的丙酸用作食品防腐劑，其安全性更易被人們接受認可;第三，現在丙酸菌已經被人們廣泛應用于乳酪工業，不存在安全性隱患;第四，相比石油化工的高污染、高能耗，發酵法生產丙酸過程溫和，環境友好性強，符合當今可持續發展和低碳工藝的理念。

產酸丙酸桿菌被認為是微生物發酵生產丙酸的最理想菌株［7］，本實驗室保存有美國俄亥俄州立大學楊尚天教授贈送的一株產酸丙酸桿菌，本文從該菌的基本生長特性、底物利用情況、產物抑制等方面出發，研究該菌發酵產丙酸的情況，并對其生長條件進行優化，最后在5L發酵罐水平研究該菌發酵葡萄糖生產丙酸的動力學，初步了解該菌發酵產丙酸的能力。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養基

菌種Propionibacterium acidipropionici ATCC 4875為美國俄亥俄州立大學楊尚天實驗室饋贈培養基成分:葡萄糖5-60 g/L，酵母抽提物10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，K2PO40.25 g/L，MnSO40.05 g/L。

1.2 儀器與設備

賽多利斯科學儀器公司生產的PB-10酸度計，Thermo Fisher Scientific公司生產的Genesys 10 vis分光光度計，廣州柯橋有限公司生產的恒溫振蕩器，上海海太光電生物科技有限公司生產的厭氧罐和自動厭氧抽排系統，德國貝朗公司生產的5LBraun型發酵罐，Waters公司生產的Waters2695高效液相色譜儀，Milford公司生產的RI-2414視差折光檢測器，美國Bio-Rad公司生產的Aminex HPX-87H型有機酸柱。

1.3 菌體生長特性研究

在搖瓶水平對該菌的生長特性進行研究，所用搖瓶規格為100 mL血清瓶，以膠塞密封，充高純氮氣保證產酸丙酸桿菌生長所需的厭氧環境。研究內容包括菌體生長曲線及初始pH、溫度、搖床轉速、接種量、種齡對產酸丙酸桿菌生長和產酸的影響，探討該菌可以利用的碳源譜、氮源譜范圍，不同初始葡萄糖濃度對產酸丙酸桿菌生長和產酸的影響，為了解丙酸鹽對菌體的產物抑制情況，對不同初始濃度的丙酸鹽(丙酸鈉和丙酸鈣)進行了研究。

1.4 5 L罐發酵動力學研究

以1.3中確定的丙酸菌最適生長條件，往5 L發酵罐中通入高純氮氣保證發酵過程中的厭氧環境，研究產酸丙酸桿菌利用葡萄糖發酵生產丙酸的動力學。

1.5 測定方法

1.5.1 生長量測定 取不同時間的發酵液，用Genesys 10 Vis分光光度計在600 nm處測定吸光值。通過吸光值與對應細胞干重的校正曲線得出，1個吸光度值對應約0.362 g/L的細胞干重。

1.5.2 殘糖及發酵產物的檢測 使用Waters2695液相色譜儀，檢測器為Milford RI-2414型視差折光檢測器，色譜柱為Aminex HPX-87H柱，柱溫為60℃，以25 mmol/L的H2SO4為流動相，流速為0.6 mL/min。

2 結果與討論

2.1 生長曲線的測定

以5%的接種量接種至50 mL培養基中，混勻后使用無菌注射器抽取8 mL于15 mL西林瓶中，放置于32℃、150 r/min搖床中培養72 h，每隔4 h測定一次菌液OD600，得到 P.acidipropionici的生長曲線測定結果，如圖1所示，從圖中的生長曲線可以看出，延遲期大約為10 h，50 h后即進入穩定生長期，菌體生長最大OD600為7.5左右。

圖1 產酸丙酸桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of P.acidipropionici

2.2 溫度、初始pH、搖床轉速、種齡及接種量對產酸丙酸桿菌菌生長和產酸的影響

在5 g/L葡萄糖濃度的培養基中，研究溫度、pH、搖床轉速、種齡、接種量對產酸丙酸桿菌的影響，結果如下圖2所示:

溫度和初始pH作為發酵的重要影響因素［8-9］，菌體及體內各種酶均隨溫度和pH的變化而受到影響。由圖2(A)和(B)可知，產酸丙酸桿菌生長及產酸最適溫度為32℃，最適pH為7.0，此時菌體干重及丙酸產量均達到最大值，菌體干重分別為2.10 g/L和2.28 g/L，丙酸濃度分別為2.10 g/L 和 2.71 g/L。因種子液中產物有酸，pH呈酸性，接種后會造成培養基初始pH的下降，故在發酵罐水平控制pH在6.5左右。由圖2(C)知，搖床轉速控制在150 r/min時，產酸丙酸桿菌菌體及產酸均達到最大值，分別為1.84 g/L 和1.97 g/L。由圖2(D)看出，接種24 h種齡丙酸菌，發酵液中菌體及丙酸產量達最大值，分別為 1.98 g/L 和 1.95 g/L。由圖 2(E)得出，1%、3%的接種量下，菌體生長延遲期較長，在8%、10%的高接種量下，菌體達到穩定期后，容易衰亡，因此確定5%是最佳接種量值，此時，菌體及丙酸產量分別為1.82 g/L 和 1.98 g/L(圖2 F 所示)。

2.3 碳源、氮源發酵實驗

不同微生物菌種具有不同的碳源譜和氮源譜，在5 g/L碳源濃度下，培養36 h，測得菌體產量，結果如圖3(A)所示;在 1.4 g/L氮元素濃度下，培養36 h，測得菌體產量，結果如圖3(B)所示:

由圖3(A)得出，產酸丙酸桿菌能夠利用的底物范圍很廣，多數單糖(戊碳糖和六碳糖)和雙糖均可被產酸丙酸桿菌利用，需要指出的是，乳酸鹽和甘油作為兩種特殊的碳源，也可以被該菌利用。近年來，生物柴油作為一項研究熱點，在其生產過程中，會產生大量的甘油副產物［10-11］，這一廉價的副產物原料對于產酸丙酸桿菌而言是一很有前景的廉價碳源。由圖3(B)得出，該菌不能利用無機氮源，而酵母抽提物和胰蛋白胨兩種氮源混合使用，對該菌生長具有促進作用，與單獨以等量的酵母抽提物或胰蛋白胨為氮源，菌體產量要高出30.49%和282.14%(2.15 g/L vs.1.64 g/L 和 0.56 g/L)。

2.4 不同初始葡萄糖濃度對產酸丙酸桿菌生長及產酸的影響

通常高底物濃度會對菌體生長產生抑制現象，在不同初始葡萄糖濃度培養基中，考察其對產酸丙酸桿菌生長及產酸的影響，結果如圖4、5所示:

由圖4得出，當葡萄糖濃度由10 g/L到50 g/L范圍內，丙酸菌生長曲線沒有很大變化，沒有顯現出明顯的底物抑制現象，相反在低葡萄糖濃度下(5 g/L)，丙酸菌菌體產量較低，且在發酵末期，因為碳源耗盡而出現菌體衰亡的現象。在100 g/L下，菌體生長延遲期較長，且菌體產量較低。此現象與所采用的實驗方法有關，因為是在密封的血清瓶中培養，培養基經高壓滅菌后，經檢測100 g/L葡萄糖所對應的培養基的理化性質發生了很大改變，培養基顏色加深，pH由7.0左右降低到5.45左右，由5.2中結論可知，pH是造成丙酸菌生長緩慢的重要原因，因而還不能得出，高濃度的葡萄糖濃度(100 g/L)對丙酸菌生長具有底物抑制現象。

由圖5可知，在搖瓶培養階段，因為丙酸的強產物抑制現象，丙酸濃度達4.5 g/L左右，即不再消耗底物。在5 g/L葡萄糖濃度下，經過36 h發酵，葡萄糖被耗盡，丙酸終濃度達2.1 g/L。在10 g/L葡萄糖濃度下，因為丙酸的強底物抑制，經過80 h發酵后，殘糖濃度為 1.8 g/L，發酵液中丙酸達 4.2 g/L，此時，細胞干重維持在一穩定值3.7 g/L，丙酸濃度也不再上升。

2.5 不同初始丙酸鹽濃度對產酸丙酸桿菌生長的影響

以10 g/L葡萄糖為碳源，考察不同丙酸鹽濃度對產酸丙酸桿菌生長的影響，結果如下圖所示:

圖2 溫度，初始pH，搖床轉速，種齡，接種量對產酸丙酸桿菌的影響Fig.2 The compare of temperature，initial pH，speed of incubator，age of seed culture，initial cell concentration for P.acidipropionici;(A)Temperature;(B)Initial pH;(C)Speed of incubator;(D)Age of seed culture;(E)(F)Initial cell concentration

圖3 不同碳源和氮源對產酸丙酸桿菌生長的影響Fig.3 Influence of different carbon and nitrogen sources on the growth of P.acidipropionici

圖4 不同濃度葡萄糖對丙酸生長的影響Fig.4 Growth curve of P.acidipropionici effected by different glucose concentration

圖5 不同濃度葡萄糖對丙酸發酵的影響Fig.5 Propionic acid fermentation effected by different glucose concentration

由圖6可知，隨丙酸鹽濃度的增加，產酸丙酸桿菌菌體產量逐漸下降。初始丙酸鹽濃度在2 g/L時，菌體生長即受抑制，與對照相比菌體產量減少62.43%(2.988 g/L vs.7.953 g/L);當初始丙酸鹽濃度為20 g/L時，丙酸菌基本不生長。國外已經有很多文獻報道過關于丙酸的強產物抑制現象，并指出丙酸的強產物抑制是造成微生物發酵法生產丙酸濃度低，產物轉化率低和產率低的重要原因［12］。

2.6 5 L發酵罐發酵生產丙酸動力學

在搖瓶培養階段，隨著菌體生長，發酵液pH逐漸降低，在pH值小于4.5時，產酸丙酸桿菌生長極其緩慢，產物生成也相應終止，為探討在調控pH的條件下，產酸丙酸桿菌生長量及產酸水平，按照搖瓶培養階段確定的最佳發酵條件，溫度32℃，pH 6.5，取培養24 h的種子液，以5%的接種量接種，在5 L罐水平上考察產酸丙酸桿菌生產丙酸的發酵動力學，結果如圖7所示:

圖6 不同濃度丙酸鹽對丙酸菌生長的影響Fig.6 Cell biomass of Propionibacterium acidipropionici effected by different propionate concentrations

圖7 游離產酸丙酸桿菌生產丙酸的發酵動力學曲線 Fig.7 Kinetics of propionic acid production by free P.acidipropionici cells at pH 6.5 and 32 ℃

如圖7所示，經過76 h的發酵，葡萄糖(初始濃度58.8 g/L)即被消耗完全。丙酸終濃度達22.4 g/L，丙酸得率和產率分別為0.381 g/g和0.295 g/L/h，同時有4.23 g/L的乙酸和4.44 g/L的琥珀酸產生，菌體產量達8.81 g/L，丙酸占總酸含量的72.10%。

國內儀宏等人［13］，利用薛氏丙酸桿菌發酵生產丙酸，批次發酵得丙酸終濃20.9 g/L，丙酸得率為0.40 g/g;馮小海等人［14］，利用費氏丙酸桿菌，初始葡萄糖濃度為40 g/L，游離細胞發酵120 h后，丙酸終濃度達 12.58 g/L，丙酸產率僅為 0.12 g/L/h，采用FBB固定化發酵生產丙酸，經補料發酵280 h，丙酸產量達45.91 g/L，為國內有關丙酸產量報道的最高值。

3 結論和展望

(1)通過對產酸丙酸桿菌基本生長特性的研究，確定其最適生長溫度為32℃，最適初始pH值為6.5，最佳搖床轉速為150 r/min，最佳接種菌齡為24 h，最佳接種量為5%;

(2)通過對不同初始葡萄糖濃度的研究，得出在產酸丙酸桿菌生長過程中，無明顯底物抑制現象;

(3)產酸丙酸桿菌可利用碳源種類十分豐富，一般的單糖、雙糖均可利用，能夠以乳酸鹽和甘油為碳源，但不能利用淀粉等多糖，酵母抽提物和胰蛋白胨對該菌生長具有協同促進作用;

(3)丙酸鹽濃度高于2 g/L時，產酸丙酸桿菌生長受明顯抑制;

(4)在5 L發酵罐中，初始葡萄糖濃度為58.8 g/L，經72 h發酵，丙酸、乙酸、琥珀酸終濃度分別達22.4 g/L、4.23 g/L、4.44 g/L，丙酸得率和產率分別為 0.381 g/g和 0.295 g/L/h。

(5)與國內同行相比，在游離細胞發酵中，產酸丙酸桿菌發酵生產丙酸具有一定優勢，為提高丙酸發酵水平，可考慮采用固定化細胞發酵工藝來實現。

致謝!

［1］BOYAVAL P，CORRE C.Production of propionic acid［J］.Lait，1995，75:453-461.

［2］KUMAR S，BABU B V.A brief review on propionic acid:a renewal energy source［D］.National Conference On Environmental Conservation，2006:459-464.

［3］GOSWAMI V，SRIVASTAVA A K.Fed-batch propionic acid production by Propionibacterium acidpropionici［J］.Biochemical Engineering Journal，2000，4:121-128.

［4］LIU Y，ZHANG Y G，ZHANG R B，et al.Glycerol/glucose cofermentation:one more proficient process to produce propionic acid by Propionibacterium acidipropionici［J］.Curr Microbiol，2009，62(1):152-158.

［5］董翠平，郝興鋒.丙酸的生產技術及市場前景［J］.精細石油化工進展，2003，4(2):51-54.DONG Cuiping，HAO Xingfeng.Production technologies and market prospect of propionic acid［J］.Advances In Fine Petrochemicals，2003，4(2):51-54.

［6］FENG X H，CHEN F，XU H，et al.Green and economical production of propionic acid by Propionibacterium freudenreichii CCTCC M207015 in plant fibrous-bed bioreactor［J］.Bioresource Technology，2011，102:6141-6146.

［7］COLOMBAN A，ROGER L，BOYAVAL P.Production of propionic acid from whey permeate by sequential fermentation，ultrofiltration，and cell recycling［J］.Biotechnology and Bioengineering，1993，43(9):1091-1098.

［8］儲炬，李友榮.現代工業發酵調控學［M］.北京:化學工業出版社，2002:41-43.CHU Ju，LI Yourong.Modern concepts of industrial fermentation［M］.Beijing:Chemical Industry Press，2002:41-43.

［9］KARADAG D，PUHAKKA J A.Direction of glucose fermentation towards hydrogen or ethanol production through on-line pH control［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2010，35:10245-10251.

［10］MARCHETTI J M，MIGUEL V U，ERRAZU A F.Possible methods for biodiesel production［J］.Renew Sustain Energy Rev，2007，11:1300-1311.

［11］DU W，XU Y，LIU D.Lipase-catalyzed transesterification of soya bean oil for biodiesel production during continuous batch operation［J］.Biotechnol Appl Biochem，2003，38:103-106.

［12］GU Z，GLZTZ B A，GLZTZ C E.Effects of propionic acid on propionibacteria fermentation［J］.Enzyme and Microbial Technology，1998，22:13-18.

［13］儀宏，王麗麗，馮惠勇，等.丙酸積累對薛氏丙酸桿菌生長及產酸的影響［J］.微生物學通報，2003，30(3):29-32.YI Hong，WANG Lili，FENG Huiyong，et al.The effects of propanoic acid accumulation on the growth and acid－production of Propionibacterium shermanii［J］.Microbiology，2003，30(3):29-32.

［14］馮小海，吳波，濃曉波，等.利用纖維床反應器固定化發酵生產丙酸［J］.生物工程學報，2008，24(6):1075-1079.FENG Xiaohai，WU Xiaobo，SHEN Xiaobo，et al.Propionic acid fermentation by Propionibacterium freudenreichii CCTCC M207015 with a fibrous-bed bioreactor［J］.Chin J Biotech，2008，24(6):1075-1079.