改良激素法建立早期股骨頭壞死動物模型①

閔紅巍，劉克敏，王安慶，韓新祚，顧蕊

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)高發于30～50歲人群，治療困難且致殘率高，是臨床骨科急待解決的重大課題。激素性ONFH是非創傷性ONFH的主要原因之一，確切的發病機制尚不明確，其病變晚期不可逆。目前，ONFH研究的一個重點是早期診斷，希望通過中西藥物、體外震波、自體骨髓干細胞移植等方法使早期的ONFH逆轉，有極大的臨床價值。而研究早期診斷的主要方法是建立早期的ONFH的動物模型。本實驗通過改良激素法有效地復制出接近臨床的早期ONFH動物模型，適用于ONFH發病機制及早期診斷等方面的研究。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

健康雄性比格犬20只，由首都醫科大學動物中心提供，體重(6.0±0.5)kg，適應性飼養1周后編號，用隨機數字表法將其分為實驗組和對照組，每組各10只。飼養溫度(22±3)℃，濕度(50±20)%，分籠在相同條件下喂養。

1.2 動物模型的制備

實驗組肌注脂多糖(美國SIGMA公司)10 μg/kg，然后連續3 d肌注甲基潑尼松龍(美國普強藥廠產品)20 mg/kg；對照組肌注等量生理鹽水。

1.3 觀察內容及方法

1.3.1 一般行為學觀察 連續4個月對各組比格犬進行一般狀態的觀察，包括精神狀態、毛色、姿勢、體重等。

1.3.2 血液學檢查 兩組動物注射藥物前和注射藥物后24 h抽靜脈全血2 ml進行凝血功能測定(ACL200全自動血凝分析儀，美國貝克曼-庫兒特公司)，包括血漿凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血酶時間(APTT)、抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)。

1.3.3 MRI檢查 全部犬在注射藥物后2個月、4個月分別行股骨頭軸位、冠狀位掃描。掃描采用1.5 T超導型磁共振機(Philips)。速眠新(長春軍事醫學科學院軍事獸醫研究所)0.2 ml/kg肌肉注射麻醉后，將比格犬仰臥位置于髖關節線圈內，髖關節及膝關節彎曲成適當角度后固定于線圈上，采用SE序列T1WI(TR/TE=358/18 ms)、 T2WI(TR/TE=1015/1000 ms)進 行 掃 描 ，層厚4 mm，間隔4 mm，FOV 210，矩陣256×256，掃描范圍130 mm。MRI均由兩位放射診斷科醫師閱片，觀察有無軟骨及軟骨下骨質形態和信號改變。

1.3.4 組織形態學觀察 注射藥物后2個月、4個月，兩組各處死5只動物。速眠新麻醉效果滿意后，取髖關節后外側切口，逐層切開組織顯露髖關節，顯露出股骨上端，用電鋸行股骨上端截骨，取下股骨頭，大體標本觀察包括股骨頭外形改變和關節軟骨面的改變。

標本沿冠狀面切開后置于10%福爾馬林溶液中固定2周，10%硝酸脫鈣1周，沖水過夜后，按常規方法沿股骨頭冠狀面切片，層厚1.0 μm，進行HE染色。由兩位病理科醫師于顯微鏡(Olympus)下觀察股骨頭區骨髓水腫情況、血管改變(壓跡、血栓等)、髓腔造血細胞和脂肪細胞的數量變化、壞死情況，骨細胞壞死情況、空陷窩數、骨小梁數量和周圍成骨情況，以及軟骨面塌陷和軟骨下骨板情況。

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件對用藥前后兩組動物的凝血參數進行配對t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 一般形態觀察結果

動物形態：兩組動物形態未見明顯改變，無消瘦、腹脹、四肢變細等，實驗期間無動物出現死亡。

股骨外形：股骨頭形態正常，軟骨面光滑，無塌陷，切面肉眼觀察未見明確的壞死灶。

2.2 鏡下結構

對照組10只動物的20個股骨頭在用藥后2個月、4個月時，可見軟骨細胞排列整齊，軟骨下血管豐富，骨小梁整齊清晰，排列規則，骨小梁中的骨細胞清晰可見，周圍成骨細胞豐富，空陷窩少見，髓腔內造血細胞豐富，形態正常。見圖1。

實驗組用藥后2個月，5只動物有4髖出現ONFH，表現為脂肪細胞肥大，髓腔造血細胞減少，骨小梁變細，間距增大，結構紊亂，部分有斷裂現象，骨小梁內骨細胞核固縮，胞核小，空陷窩數增多。骨髓表現為片狀壞死。見圖2。

實驗組用藥后4個月，5只動物有6髖出現ONFH，表現為骨髓造血細胞極少，充滿脂肪細胞，骨小梁中斷，空陷窩增多，壞死骨小梁周圍可見少量成骨細胞，壞死灶可見炎細胞和少量新生血管，部分壞死灶周圍見纖維血管組織修復。見圖3。

2.3 影像學表現

對照組應用藥物后2個月和4個月，10只犬的20個股骨頭形態正常，T1WI表現為高信號，T2WI表現為低或中等信號，MRI未見異常信號改變。見圖4。實驗組應用藥物后2個月和4個月后，10只犬的20個股骨頭形態正常，MRI未見異常信號改變。見圖4。

圖1 對照組正常病理圖(HE染色)

圖2 實驗組用藥2個月后(HE染色)

圖3 實驗組用藥4個月后(HE染色)

圖4 兩組MRI(股骨頭形態均正常，未見異常信號)

2.4 血液學指標檢測結果

用藥前，兩組間PT、APTT、AT-Ⅲ均無顯著性差異(P＞0.05)。注射后，實驗組PT、APTT、AT-Ⅲ均顯著縮短(P＜0.001)，且顯著短于對照組(P＜0.001)。見表1～表3。

表1 兩組用藥前后PT比較(s)

表2 兩組用藥前后APPT比較(s)

表3 兩組用藥前后AT-Ⅲ比較(s)

3 討論

ONFH是一種常見的致殘率較高的骨科疾病。1957年，Pietrogrand等首次報道糖皮質激素易引起ONFH，但到目前為止人們還沒完全弄清楚其發病機制[1]。因此，建立理想的成人ONFH的動物模型，是研究成人ONFH病因及發病機制十分重要的手段，也是進行治療的基礎。目前ONFH的造模方法主要有：創傷法(損傷股骨頸骨膜、髖關節脫位并且切斷圓韌帶[2-4])；物理法(如液氮冷凍[5]、微波[6]等)；化學法(股骨頭內注射乙醇[7])；非創傷法(激素、內毒素或血管內皮細胞生長因子受體抗體誘導[8-12])。實驗動物大多為四足動物和兩足動物。前者主要包括鼠、兔、犬、豬、綿羊、山羊及馬，后者包括雞、鵝、鴯鹋。

長期使用或短期內間斷大量使用糖皮質激素可引起ONFH，已為臨床和實驗研究證實，人和動物對皮質激素的反應是一致的[13]。但激素應用劑量、時間與骨壞死產生的關系仍不確切；同樣應用激素治療，而ONFH的發生率及病變范圍卻有差異。曾有人認為在健康的動物單純應用激素可能不引起骨壞死，但從目前的文獻報道來看，這種推測比較武斷。也有學者認為并不是單純激素不能導致骨壞死，而是激素應用的劑量、次數、應用方式(沖擊或持續應用)以及動物個體對激素的耐受性不同。

臨床上，腎病綜合征、感染性休克、妊娠并發癥、惡性腫瘤、系統性紅斑狼瘡等是應用激素較多且較易出現ONFH的疾病，而這些疾病有一個共同特點，即在使用激素前就已經存在前凝血狀況。因此，利用施瓦茲曼反應(Schwartzman reaction)首先造成動物的前凝血狀況，繼而使用大劑量激素造成ONFH模型是符合臨床要求的。由于利用施瓦茲曼反應處理的動物死亡率較高，因此在本實驗中，我們采用改良施瓦茲曼反應，在大動物體內單次注射大腸桿菌內毒素聯合應用甲基潑尼松龍，用藥后2個月和4個月，病理結果顯示有4髖和6髖發生ONFH，并且無一例動物死亡。說明改良施瓦茲曼反應可以引起ONFH，且死亡率低。

雖然目前ONFH研究已達到分子及基因水平，但其確切的發病機制仍不十分清楚。1992年，Jones正式提出非創傷性骨壞死血管內凝血學說，并在隨后的研究中不斷加以完善。越來越多的研究表明ONFH的發生與凝血功能異常有關[14-16]。本研究結果顯示，應用內毒素和激素后，血漿PT、APTT、AT-Ⅲ明顯降低，表明血液處于高凝低纖溶狀態。由于血栓前狀態的存在，形成骨內微血栓，從而引起一系列的病理變化。血栓形成后，一方面可損害動脈灌注，并且更為嚴重地損害靜脈引流，導致骨內間隔綜合征，使骨內靜脈壓升高，灌注減少，進而加重了股骨頭的缺血并導致骨壞死。另一方面，被激活的凝血瀑布反應可誘發組織的炎性反應，加劇局部病變。

雖然說成人ONFH的病因及發病機制尚不完全清楚，但對其病理過程已有較清楚的認識。一般認為，無論什么原因引起成人ONFH，其病理改變都是相似的[17]，即先有細胞壞死，隨后通過血管再生，新骨形成和死骨(小梁)吸收進行修復。由于骨組織對缺血持續的時間、缺血的范圍、缺血的程度以及骨組織對缺血反應能力和狀態的不同，其病理變化的進程也有所不同；ONFH的病理改變主要是脂肪及水含量的變化，因此MRI診斷骨壞死具有很強的特異性和敏感性。盡管如此，還必須認識到。MRI信號改變仍然是骨壞死病理變化進展到相當程度的影像表現。因此，若MRI正常，也不能完全排除ONFH[18]。相信隨著磁共振技術的發展，其在ONFH診斷中的應用會越來越廣泛。

在本研究中，實驗組用藥后2個月4髖發生ONFH，其病理變化表現為脂肪細胞肥大，骨小梁變細，部分有斷裂現象，骨小梁內骨細胞核固縮，胞核小，空陷窩數增多。未見明顯修復反應，表明骨壞死處于早期階段。實驗組用藥后4個月有6髖發生ONFH，其病理變化表現為骨小梁中斷，空陷窩增多，壞死骨小梁周圍可見少量成骨細胞，壞死灶可見漿細胞和少量新生血管，部分壞死灶周圍見纖維血管組織修復。實驗組用藥后2個月和4個月MRI未見異常信號，這可能是因為壞死尚處于早期階段，同時壞死的范圍較小、修復反應比較局限。

本研究也存在著一些不足。一方面研究的樣本量相對較少，進行統計分析時說服力較弱；另一方面實驗組觀察的時間點較少，不利于動態觀察早期ONFH的病理和影像學變化。此外，四足動物造模的最大限制在于其不能正常負重。因為動物在患肢疼痛情況下常采取保護性肢體回縮，這與人髖關節負重模式有很大的不同。這也是本模型難以造成股骨頭晚期塌陷的原因之一。

總之，改良激素法可建立早期ONFH模型，其具有創傷小、造模方法簡單、成模時間短、動物死亡率低、其病理特點貼近人ONFH病理演變規律等優點，是一種比較理想的造模方式。

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